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口蹄疫病毒3ABC-ELISA诊断方法的建立

作　者: 王冰
导　师: 朴范泽；于力
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC 鉴别诊断间接ELISA
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的动物的一种烈性传染病,该病传播速度快,宿主范围广,发病率高,主要侵害猪、牛、羊等经济价值较大的动物,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病之首。对于口蹄疫的防控,发达国家一般采用扑杀的措施来快速消灭该病,而大多数发展中国家主要采取疫苗免疫的综合防制措施来防止本病的发生。因此,建立一种诊断方法鉴别疫苗免疫动物与自然感染动物以及筛查隐性感染动物,成为FMD防制的重要工作之一。本研究采用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中分别表达口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC、3AB和3B,SDS-PAGE分析表明3ABC和3AB均得到高效表达,其大小分别为37 Ku和26 Ku,经Western blot检测证实3ABC的反应原性最好。通过电洗脱方法得到纯化的3ABC蛋白,将其作为包被抗原,初步建立了口蹄疫3ABC-ELISA鉴别诊断方法,并对试验条件进行了优化。确定抗原的最佳包被浓度为2.5μg/mL,脱脂乳封闭1h封闭效果最好,检测抗体最佳作用时间为1 h,底物最佳作用时间为15 min。敏感性试验表明,当阳性血清稀释度为1:1280时仍可检出;重复性试验表明,本方法批内重复的变异系数均小于7%,批间重复的变异系数均小于15%;交叉试验表明,本方法检测牛传染性鼻气管炎、牛流热、赤羽病、牛胸膜肺炎等血清,均不发生交叉反应,具有良好的特异性。符合性试验表明,与中国农业科学院兰州兽医研究所生产试剂盒的符合率为86.4%,与北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产试剂盒的符合率为77.3%。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章文献综述  9-21
  1.1 口蹄疫概述  9-10
  1.2 FMDV 基本结构研究概况  10-14
    1.2.1 5′-UTR  11
    1.2.2 3′-UTR  11
    1.2.3 Poly(A)尾巴  11-12
    1.2.4 ORF  12-14
  1.3 口蹄疫的诊断学研究进展  14-20
    1.3.1 临床诊断  14
    1.3.2 样品采集  14
    1.3.3 病原学诊断  14-15
    1.3.4 病原检测  15-16
    1.3.5 抗体检测  16-17
    1.3.6 RT-PCR 技术  17-18
    1.3.7 新诊断技术研究进展  18
    1.3.8 FMDV 自然感染动物和免疫接种动物的区分  18-20
  1.4 本研究的目的和意义  20-21
第二章口蹄疫病毒免疫接种和自然感染动物3ABC-ELISA鉴别诊断方法的建立  21-44
  2.1 材料  21-23
    2.1.1 质粒和菌株  21
    2.1.2 载体  21-22
    2.1.3 主要试剂  22
    2.1.4 主要仪器  22
    2.1.5 细胞系及其培养基  22-23
    2.1.6 引物的设计与合成  23
  2.2 方法  23-32
    2.2.1 PCR 扩增  23-24
    2.2.2 PCR 产物的纯化、回收  24
    2.2.3 利用Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统构建重组病毒  24-30
    2.2.4 重组蛋白的表达与检测  30
    2.2.5 重组蛋白的纯化  30
    2.2.6 3ABC-ELISA 鉴别诊断方法的建立  30-32
  2.3 结果  32-41
    2.3.1 PCR  32-33
    2.3.2 重组转移载体的鉴定  33
    2.3.3 目的基因的序列测定  33-34
    2.3.4 重组杆状病毒穿梭质粒的鉴定  34
    2.3.5 重组杆状病毒的鉴定  34-36
    2.3.6 3ABC 蛋白的纯化  36-37
    2.3.7 3ABC-ELISA 的建立  37-41
  2.4 讨论  41-44
第三章结论  44-45
参考文献  45-54
致谢  54-55
附录  55-61
  附录Ⅰ常用溶液的配制  55-58
  附录Ⅱ测序结果  58-61
个人简历  61

口蹄疫病毒3ABC-ELISA诊断方法的建立

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