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O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因重组腺病毒载体的构建

作　者: 李杨
导　师: 柳纪省；胡永浩
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: O型口蹄疫病毒同源重组复制缺陷型腺病毒表达载体
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起猪、牛、羊等偶蹄动物的一种烈性传染病,严重危害畜牧业健康发展,对国民经济造成巨大的损失,世界各国非常重视该病的研究和防治。由于传统灭活疫苗存在着难以避免的安全隐患等问题,故研制高效、安全、价廉的口蹄疫基因工程疫苗势在必行。本实验运用RT-PCR方法分别扩增O型口蹄疫病毒OMⅢ株的P1-2A和3C基因,将P1-2A和3C基因分别克隆入质粒载体pMD18-T,对筛选所获得的含有P12A和3C基因的质粒进行全基因序列测定,接着用DNAStar软件进行序列对比分析,结果表明:成功地克隆出具有OMⅢ株的P1-2A和3C基因。将这两个基因定向亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,得到重组载体pAdTrack-P12A3C,该重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体pAdeasy-1经电转化共同进入大肠杆菌BJ5183感受态细胞后得到重组腺病毒质粒pAd-P12A3C。将该重组腺病毒质粒线性化后转染至HEK293细胞中得到重组腺病毒。对重组病毒进行继代培养,每代提取病毒基因组并扩增P1-2A、3C片段证实外源基因在重组腺病毒中具有遗传稳定性。动物试验及抗体水平检测结果表明:用重组腺病毒试制的疫苗免疫小鼠后可用液相阻断ELISA法检测到抗体。该实验为研制重组复制缺陷型腺病毒载体口蹄疫疫苗奠定了基础。

全文目录

摘要  2-3
Summary  3-4
英文缩略表  4-9
前言  9-11
第一部分文献综述  11-30
  1 口蹄疫概述  11-12
  2 FMDV 分子生物学特性研究进展  12-30
    2.1 FMDV 基因组结构特点  12-13
    2.2 FMDV 5′非翻译区（5′-UTR）  13-16
      2.2.1 蛋白质帽状结构(cap)  13
      2.2.2 FMDV S 片段、poly(C)区、假结（PKs）和顺式复制元件(cre)  13-14
      2.2.3 FMDV 内部核糖体进入位点(IRES)  14-15
      2.2.4 FMDV L 区  15-16
    2.3 FMDV 结构蛋白和非结构蛋白  16-20
      2.3.1 FMDV 结构蛋白  16
      2.3.2 FMDV 非结构蛋白  16-19
        2.3.2.1 FMDV 2A/B/C  17
        2.3.2.2 FMDV 3A/B  17-18
        2.3.2.3 FMDV 3C 蛋白酶(3Cpro)  18-19
        2.3.2.4 FMDV 3D 聚合酶(3Dpol)  19
      2.3.3 FMDV 3′非翻译区  19-20
    2.4 口蹄疫病毒的病毒粒子结构特点  20-21
    3 口蹄疫病毒疫苗的研究进展  21
    3.1 传统疫苗  21-23
      3.1.1 弱毒疫苗  21
      3.1.2 灭活疫苗  21-23
    3.2 新型疫苗  23-28
      3.2.1 病毒活载体疫苗  23-26
        3.2.1.1 FMDV 腺病毒重组活载体疫苗  23-25
        3.2.1.2 FMDV 痘病毒重组活载体疫苗  25-26
        3.2.1.3 FMDV 疱疹病毒重组活载体疫苗  26
      3.2.2 核酸疫苗  26-27
      3.2.3 合成肽疫苗  27
      3.2.4 转基因植物疫苗  27-28
    4 总结  28-30
第二部分实验研究  30-48
  1 材料  30-31
    1.1 实验材料  30
    1.2 仪器与设备  30-31
    1.3 实验动物  31
    1.4 细胞  31
  2 方法  31-42
    2.1 病毒RNA 的提取  31-32
    2.2 口蹄疫P1-2A、3C 重组腺病毒穿梭质粒的构建  32-37
      2.2.1 FMDV P1-2A 和3C 基因的扩增  32-33
      2.2.2 目的基因的纯化与回收  33-34
      2.2.3 目的基因纯化产物与pMD18-T 载体的连接  34
      2.2.4 感受态细胞的制备  34
      2.2.5 感受态细胞的转化  34-35
      2.2.6 挑斑  35
      2.2.7 质粒DNA 的提取  35-36
      2.2.8 阳性重组质粒的鉴定  36-37
    2.3 目的片段与穿梭载体pAdTrack-CMV 的连接  37-38
      2.3.1 感受态细菌的制备及连接产物转化  38
      2.3.2 质粒DNA 的提取及重组穿梭载体质粒的鉴定  38
      2.3.3 感受态细菌的制备及连接产物转化  38
      2.3.4 质粒DNA 的提取及重组穿梭载体质粒的鉴定  38
    2.4 口蹄疫P1-2A、3C 重组腺病毒质粒的构建  38-41
      2.4.1 骨架载体pAdEasy-1 转化BJ5183 菌  40
      2.4.2 pAdEasy-1 BJ5183 细菌感受态的制备  40
      2.4.3 重组腺病毒质粒的构建  40
      2.4.4 重组腺病毒载体的鉴定  40-41
      2.4.5 用重组腺病毒质粒转化宿主菌DH10B  41
    2.5 重组腺病毒遗传稳定性检测及毒价测定  41-42
      2.5.1 脂质体介导的质粒转染HEK293 细胞  41
      2.5.2 重组腺病毒遗传稳定性的检测  41-42
      2.5.3 重组腺病毒毒价的测定  42
    2.6 动物试验及抗体水平检测  42
  3 结果  42-46
    3.1 O 型口蹄疫目的基因P1-2A、3C 的扩增和重组腺病毒穿梭质粒的构建  42-44
    3.2 重组腺病毒质粒pAd-P12A3C 的鉴定  44
    3.3 重组腺病毒遗传稳定性和目的基因表达的检测  44
    3.4 重组病毒毒价的测定  44-45
    3.5 动物试验及抗体水平检测  45-46
  4 讨论  46-48
参考文献  48-55
致谢  55-56
作者简介  56-57
导师简介  57-59

O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因重组腺病毒载体的构建

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