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绵羊FMDV受体整联蛋白αvβ6的体外表达及组织分布研究

作　者: 薛霜
导　师: 常惠芸；伏小平
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫病毒受体整联蛋白αvβ6 原核表达细胞系组织分布
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)引起的一种急性、热性和高度接触性传染病。FMDV主要利用VP1 G-H环上一段高度保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)序列与细胞表面的受体结合以感染细胞。研究表明至少有5种细胞识别机制,即细胞表面的整联蛋白αvβ3、αvβ6、αvβ1、αvβ8和硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate, HS)可作为FMDV的受体,有研究表明整联蛋白αvβ6可能是决定FMDV嗜性的主要功能受体。FMDV受体在动物体组织中的分布情况可以反映FMDV的感染途径、细胞嗜性及传播方式等,因此研究FMDV受体的生物学功能和组织分布情况对阐明其致病、逃避细胞免疫等机制具有重要作用。构建绵羊FMDV受体整联蛋白β6亚基配体结合域(LBD)的重组原核表达质粒pPRO/β6LBD,将其转化到BL21(DE3)宿主菌中并经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达并利用镍离子亲和树脂对其纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western-Blot方法分析鉴定表达产物。实验结果显示,成功诱导表达了目的蛋白,并利用pPROEXTM HTb上的6个组氨酸(His)标签纯化出高纯度的融合蛋白。纯化后的蛋白经间接ELISA和Western-Blot检测,与特异性抗体具有良好的特异性反应及抗原活性。构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/β6S,将其转染至表达人αv亚基的结肠癌细胞株SW480,间接免疫荧光法(IFA)和Western-Blot方法检测整联蛋白αvβ6在转染细胞中的表达。IFA检测结果显示,转染细胞的细胞膜及细胞质内可见致密的绿色荧光,而未转染的SW480细胞和空载体转染细胞未检测到β6亚基的表达。Western-Blot结果显示,转染β6亚基的SW480细胞表达的重组蛋白可被抗FMDV猪源整联蛋白β6亚基的单克隆抗体所特异性识别。所构建的表达绵羊整联蛋白β6亚基的细胞系为深入研究整联蛋白αvβ6在FMDV感染中的生物学作用奠定了基础。间接免疫组化和间接免疫荧光法检测整联蛋白αvβ6在健康绵羊舌、鼻、唇等组织中的表达分布。结果显示,在羊舌、鼻、唇、蹄冠等多种被检组织的细胞膜及细胞质内均出现了特异性的阳性反应物,且阳性反应物主要见于各种上皮细胞。在阴性对照组中观察不到特异性的阳性反应物。表明FMDV整联蛋白受体αvβ6广泛分布于健康绵羊的多种器官组织的上皮细胞中。利用实时定量RT-PCR方法对健康羊体内不同组织中αv、β1、β6亚基的mRNA表达水平进行相对定量分析。实验数据显示,整联蛋白αv、β1亚基在各种组织中均有不同程度的表达,而整联蛋白β6亚基仅在部分组织中检测到了表达,其中在唾液腺、心脏、肺脏、鼻上皮等组织中的表达量最高,在下颌淋巴结、肝脏和脾脏中未检测到表达。结合免疫组化和免疫荧光试验结果总结αvβ6的表达分布规律,从而为深入研究FMDV的感染途径、细胞嗜性及整联蛋白αvβ6在FMDV感染中的作用奠定基础。

全文目录

摘要  2-4
SUMMARY  4-9
英文缩略表  9-11
第一章文献综述  11-22
  1. 整联蛋白研究概况  11-16
    1.1 整联蛋白的结构  11-12
    1.2 整联蛋白介导的信号转导机理  12-15
      1.2.1 整联蛋白构象变化介导的信号转导  12-14
        1.2.1.1 αI 结构域缺失型整联蛋白  12-13
        1.2.1.2 αI 结构域型整联蛋白  13-14
        1.2.1.3 整联蛋白胞质区和跨膜区的构象变化  14
      1.2.2 整联蛋白介导的其他信号转导途径  14-15
    1.3 整联蛋白与病毒感染  15
    1.4 小结与展望  15-16
  2. 口蹄疫病毒细胞受体研究进展  16-20
    2.1 整联蛋白受体  16-19
      2.1.1 整联蛋白αvβ3  16-17
      2.1.2 整联蛋白αvβ6  17-18
      2.1.3 整联蛋白αvβ1  18
      2.1.4 整联蛋白αvβ8  18-19
    2.2 硫酸乙酰肝素受体  19-20
    2.3 其他细胞受体  20
  3. 展望  20-22
第二章绵羊FMDV 受体整联蛋白β6 亚基配体结合域的原核表达  22-34
  1 材料  22-23
    1.1 感受态细胞、原核表达载体  22
    1.2 酶和试剂  22-23
    1.3 仪器和设备  23
  2 研究方法  23-30
    2.1 重组原核表达质粒pP_(RO)/β6LBD 的构建  23-26
      2.1.1 目的基因的扩增  23
      2.1.2 PCR 产物回收  23-24
      2.1.3 目的基因与载体的双酶切  24-25
      2.1.4 目的基因与表达载体的连接转化  25
        2.1.4.1 目的基因与表达载体的连接  25
        2.1.4.2 连接产物的转化  25
      2.1.5 重组质粒的提取与鉴定  25-26
        2.1.5.1 重组质粒的提取  25-26
        2.1.5.2 重组质粒的鉴定  26
    2.2 重组蛋白的诱导表达  26-27
    2.3 表达产物的SDS-PAGE 分析  27-28
      2.3.1 蛋白凝胶的配制  27
      2.3.2 上样与电泳  27-28
    2.4 重组蛋白的可溶性分析  28
    2.5 重组蛋白的纯化  28
    2.6 重组蛋白的鉴定  28-30
      2.6.1 间接ELISA 分析  28-29
      2.6.2 Western-Blot 分析  29-30
  3 结果  30-32
    3.1 重组原核表达质粒的鉴定  30
    3.2 重组蛋白的诱导表达和纯化  30-31
    3.3 表达产物的鉴定  31-32
  4 讨论  32-34
第三章表达绵羊FMDV 受体整联蛋白β6 亚基的SW480 细胞系的构建  34-42
  1 材料  34-35
    1.1 细胞与载体  34
    1.2 酶和试剂  34
    1.3 细胞培养试剂  34
    1.4 主要仪器设备  34-35
  2 实验方法  35-37
    2.1 重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/β65 的构建  35
      2.1.1 目的基因的扩增  35
      2.1.2 重组真核表达质粒的构建与鉴定  35
    2.2 重组真核表达质粒的提取  35-36
    2.3 重组质粒转染SW480 细胞  36
    2.4 稳定表达细胞株的筛选  36-37
    2.5 重组质粒在转染细胞中表达的检测  37
      2.5.1 间接免疫荧光（IFA）检测  37
      2.5.2 Western-Blot 检测  37
  3 结果  37-40
    3.1 重组真核表达质粒的鉴定  37-38
    3.2 重组真核表达质粒的提取与浓度测定  38
    3.3 稳定表达细胞株的筛选及检测  38-40
  4 讨论  40-42
第四章免疫组化和免疫荧光法检测整联蛋白ΑVβ6 在绵羊体内组织的表达分布  42-56
  1 材料  42-43
    1.1 动物组织  42
    1.2 主要试剂  42
    1.3 主要仪器设备  42-43
  2 实验方法  43-46
    2.1 组织冰冻切片的制备  43
    2.2 检测方法  43-46
      2.2.1 间接免疫组化法  43-45
        2.2.1.1 反应条件的优化  43-44
        2.2.1.2 间接免疫组织化学显色  44-45
      2.2.2 间接免疫荧光法  45-46
  3 结果观察  46-54
    3.1 间接免疫组化法检测整联蛋白αvβ6 的组织分布  46-49
      3.1.1 间接免疫组化法的建立及优化  46
      3.1.2 整联蛋白αvβ6 的组织分布  46-49
    3.2 间接免疫荧光双标记法检测整联蛋白αvβ6 的组织分布  49-54
  4 讨论  54-56
第五章 FMDV 整联蛋白受体基因在绵羊体内组织转录水平的相对定量研究  56-68
  1 材料  56-57
    1.1 动物组织  56
    1.2 主要试剂  56
    1.3 主要仪器设备  56-57
  2 实验方法  57-59
    2.1 样品采集  57
    2.2 引物设计  57
    2.3 组织RNA 的提取和纯化  57-58
    2.4 反转录  58
    2.5 实时荧光定量PCR 体系的建立  58-59
    2.6 相对定量标准曲线的制作  59
    2.7 实验数据分析  59
  3 结果  59-66
    3.1 实时定量PCR 产物特异性分析  59-62
    3.2 相对定量标准曲线  62-65
    3.3 不同组织中目的基因m RNA 的转录水平  65-66
  4 讨论  66-68
第六章研究结论  68-69
致谢  69-70
参考文献  70-75
附录溶液的配制  75-79
作者简介  79-80
导师简介  80-81

绵羊FMDV受体整联蛋白αvβ6的体外表达及组织分布研究

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