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口蹄疫病毒前导蛋白（L~（pro））致MDBK细胞死亡方式及其分子机制初步研究

作　者: 郝峰强
导　师: 常惠芸；伏小平
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫病毒前导蛋白细胞凋亡流式细胞术胱冬酶
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

口蹄疫（Foot and Mouth Disease , FMD）是一种致多种偶蹄动物的急性、高度接触性、热性传染病,以传播迅速、感染率高著称,国际动物卫生组织（OIE）将其列为法定通报的动物疫病。口蹄疫是在全球经济贸易过程中对相关动物及动物产品贸易影响最为重要的动物疾病之一。该病一旦在某个国家或地区爆发,其动物、动物相关产品的贸易将受到致命打击。因此口蹄疫又被称为“政治-经济病”。目前口蹄疫病毒感染致宿主细胞死亡的方式尚不清楚,作用机制也不甚明了。随着分子生物学相关技术在口蹄疫病毒研究中的应用,研究者对口蹄疫病毒基因组结构和功能有了不同程度的了解。其中,口蹄疫病毒的毒性蛋白对于宿主细胞的毒性作用已经成为国内外研究的热点之一。本实验在成功构建可稳定表达口蹄疫病毒L^pro目的基因的MDBK细胞系的基础上,从细胞凋亡的角度研究L^pro蛋白酶与宿主MDBK细胞的相互作用,研究口蹄疫病毒L^pro致MDBK细胞死亡的作用方式及其分子机制。本研究以可稳定表达口蹄疫病毒L^pro蛋白酶的MDBK细胞系为研究对象,首先进行细胞系稳定性鉴定:MDBK-L细胞迅速复壮后用含四环素的DMEM连续培养并传代。分别收集待检测的MDBK-L细胞的第5、10、20、30、40代细胞及正常MDBK细胞（培养48h）,提取基因组DNA,利用PCR手段,证实Lab基因被整合到MDBK细胞基因组中,并能稳定地随宿主细胞传代;提取细胞总RNA,利用RT-PCR检测,证实Lab基因在无四环素的情况下能够被转录。将第20代阳性细胞除去四环素后进行诱导表达,收集发生病变的细胞,应用Wensten-blotting检测手段鉴定L^pro的表达。结果显示,目的蛋白与O型FMDV抗血清能特异性反应。其次,为探讨口蹄疫病毒L^pro致MDBK细胞病变效应中的形态学变化,人工诱导L^pro表达后,采用光学显微镜观察、Hoechst 33258染色、AO-EB染色、DNA Ladder等进行检测,研究口蹄疫病毒L^pro致MDBK细胞的病变效应。结果显示, MDBK细胞系在诱导表达口蹄疫病毒L^pro 24 h后,光学显微镜下细胞形态表现为细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围出现透明圈等现象; Hoechst 33258染色检测呈现典型的细胞核浓缩和梅花状核碎裂;诱导表达L^pro 36 h后, AO-EB染色显示早期病变细胞核染亮绿色呈致密斑块或碎片状,晚期病变细胞核染橘黄色呈致密斑块;DNA凝胶电泳显示可见的DNA Ladder“梯状”条带。证明口蹄疫病毒L^pro在体外可诱导MDBK细胞发生凋亡。之后通过流式细胞术对L^pro在体外可诱导MDBK细胞发生的凋亡进行了定量分析,结果显示L^pro诱导表达12h、24h、36h、48h、60h、72h后MDBK细胞凋亡率分别为3.43%,4.77%,11.01%,21.67%,29.23%与41.98%。但在诱导72h后细胞坏死率也迅速上升至20%以上,而实验组的细胞坏死率与阴性对照的细胞坏死率在诱导与培养72h前均在5%以下,无显著变化。并利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）对凋亡阳性细胞进行标记与鉴定,结果呈现大量棕黄色的TUNEL阳性细胞。最后,对口蹄疫病毒L^pro致MDBK细胞凋亡的分子机制进行了初步研究,细胞凋亡的两条主要通路分别是死亡受体介导凋亡途径（death receptor-mediated pathway or extrinsic pathway）和线粒体凋亡途径（mitochondrial pathway or intrinsic pathway）。虽然两种凋亡通路的上游事件（up-stream activation）不同,但是它们最终都要激活共同的凋亡效应物,即特异的胱冬酶（caspase）。我们利用RT-PCR和Western blot检测发现在口蹄疫病毒L^pro致MDBK细胞凋亡过程中Caspase-3在转录和翻译水平都有活化与表达。

口蹄疫病毒前导蛋白（L~（pro））致MDBK细胞死亡方式及其分子机制初步研究

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