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大菱鲆干扰素调节因子3（IRF-3）和干扰素调节因子7（IRF-7）基因克隆与表达分析

作　者: 夏军
导　师: 胡国斌
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生物工程
关键词: 大菱鲆(Scophthalmus maximus) 干扰素系统 干扰素调节因子3(IRF-3) 干扰素调节因子7(IRF-7) 基因表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


大菱鲆(Scophthalmus maximus)是我国北方一种重要的海水养殖鱼类品种。近年来,随着人工养殖规模的迅速扩大,病害问题日益严重,尤其是病毒性疾病如大菱鲆红体病给我国大菱鲆养殖业带来了较大的经济损失。作为多功能转录因子,干扰素调节因子(Interferon regulatory factors, IRFs),特别是IRF-3和IRF-7,在干扰素(Interferon, IFN)的转录调控、病原体的免疫反应等方面起到非常重要的作用。因此,对大菱鲆干扰素系统的深入研究在大菱鲆病毒性疾病的防治上具有重要的理论和现实意义。目前,大菱鲆IRF-3 (SmIRF-3)和IRF-7 (SmIRF-7)尚未被克隆和研究。本文采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、同源PCR克隆(Homology PCR Cloning)和cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)技术,从大菱鲆头肾组织中获得IRF-3和IRF-7基因的全长cDNA和基因组DNA。大菱鲆IRF-3 cDNA(GenBank登录号:HQ424131)全长为2820 bp,完整开放阅读框长1398 bp,编码466个氨基酸,5’非翻译区长242 bp,3’非翻译区长1180 bp。IRF-3基因组DNA全长6077 bp,包括11个外显子和10个内含子。大菱鲆IRF-7基因cDNA (GenBank登录号:HQ424129)全长为1976 bp,完整开放阅读框长1308 bp,编码436个氨基酸,5’非翻译区长13 bp,3’非翻译区长646 bp。IRF-7基因组DNA(GenBank登录号:HQ424130)全长3999 bp,包括10个外显子和9个内含子。同其他鱼类IRF-3和IRF-7编码的氨基酸类似,大菱鲆IRF-3和IRF-7编码的氨基酸序列也具有典型的DNA结合域(DNA binding domain, DBD)、IRF相关域(IRF association domain, IAD)和丝氨酸富含域(Serine-rich domain, SRD)。与其他脊椎动物的IRF-3和IRF-7氨基酸序列比对发现,大菱鲆IRF-3和IRF-7与它们具有较高的同源性。系统进化分析表明大菱鲆IRF-3和IRF-7属于IRF-3亚家族的两个不同成员,它们可能来自共同的祖先基因。采用RT-PCR方法对IRF-3和IRF-7这两个基因在健康大菱鲆脑、鳃、胃、肠、心、头肾、体肾、肝、脾、性腺、肌肉和皮肤12个组织中表达分布情况进行了研究。实验结果表明,IRF-3基因在头肾、体肾和脾中表达水平较高,中等程度表达于鳃和肠,在胃、心、肝中表达较弱,而在脑、性腺、肌肉和皮肤中几乎没有表达。大菱鲆IRF-7基因在所研究的组织中均有较明显的表达。其中,高水平表达于脑、胃、肠、心、头肾、体肾、脾和性腺中,中等程度表达于鳃、肝、肌肉和皮肤中。为了解大菱鲆IRF-3和IRF-7基因的表达规律及其在干扰素信号系统中的地位与作用,实验在不同的时间点用大菱鲆红体病毒(TRBIV)感染健康的大菱鲆,并检测感染0、1、2、3、4、5、7天后SmIRF-3、SmIRF-7和Mx三个基因在头肾、脾、鳃和肌肉组织中的表达情况。研究结果发现,经TRBIV感染的大菱鲆头肾和肌肉组织中,IRF-3、IRF-7和Mx三个基因均上调表达。在头肾中,SmIRF-3、SmIRF-7和Mx表达峰值分别出现在病毒感染后的第一天、第二天和第四天,表达量是对照水平的10倍、12倍和6倍。在脾中,SmIRF-3和Mx表达峰值均出现在病毒感染后的第一天,表达量是对照水平的16倍和4.7倍。在鳃中,SmIRF-3和Mx表达峰值分别出现在病毒感染后的第二天和第四天,表达量是对照水平的3.7倍和2.8倍。在肌肉中,SmIRF-7和Mx表达峰值分别出现在病毒感染后的第二天和第五天,表达量是对照水平的4.5倍和2.8倍,这些结果呈现出一定规律性,表明IRF-3和IRF-7在鱼类抗病毒反应中起着重要的作用。本文成功克隆到大菱鲆IRF-3和7的全长cDNA序列和基因组序列,并对其表达情况进行了相关的分析,了解了IRF-3、IRF-7及Mx基因的联动表达规律,为深入研究鱼类干扰素系统的信号转导途径、有效开展大菱鲆病毒性疾病的免疫防治等工作创造了条件。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章 文献综述  12-22
  1 鱼类干扰素系统的研究进展  12-16
    1.1 鱼类干扰素系统  12
    1.2 鱼类干扰素分子的发现及研究  12-13
    1.3 鱼类干扰素的理化性质及分类  13-14
    1.4 鱼类干扰素的生物学功能  14-16
      1.4.1 鱼类干扰素的信号通路  14-15
      1.4.2 鱼类干扰素的功能  15-16
  2 鱼类干扰素调节因子的研究进展  16-21
    2.1 鱼类干扰素调节因子的结构和分类  17
    2.2 鱼类干扰素调节因子的生物学功能  17-18
    2.3 鱼类IRF-3 和IRF-7 的研究进展  18-21
      2.3.1 IRF-3 和IRF-7 的分子结构  18-19
      2.3.2 IRF-3 和IRF-7 的表达特点  19-20
      2.3.3 IRF-3 和IRF-7 在干扰素系统信号转导中的重要作用  20-21
  3 本项研究的目的与意义  21-22
第二章 大菱鲆 IRF-3 和 IRF-7 基因的克隆和序列分析  22-56
  1 实验材料  22-24
    1.1 实验动物、菌株及质粒  22
    1.2 主要仪器与设备  22-23
    1.3 主要试剂及溶液的配制  23-24
      1.3.1 主要试剂  23
      1.3.2 溶液的配制  23-24
  2 实验方法  24-31
    2.1 大菱鲆组织的获取  24
    2.2 总RNA 的提取及质量检测  24-25
    2.3 cDNA 第一链的合成  25
    2.4 大菱鲆IRF-3 和IRF-7 全长cDNA 的克隆  25-29
      2.4.1 核心片段的克隆及测序  25-27
      2.4.2 3’-RACE 和5’-RACE 片段的克隆及测序  27-29
      2.4.3 全长cDNA 序列的拼接及验证  29
    2.5 大菱鲆IRF-3 和IRF-7 基因序列的克隆  29-31
      2.5.1 引物设计  29-30
      2.5.2 大菱鲆基因组DNA 的提取  30
      2.5.3 基因组DNA 的克隆及测序  30-31
    2.6 序列分析与进化树的构建  31
  3 结果分析  31-54
    3.1 RNA 样品的制备与质量检测  31
    3.2 核心片段的克隆及测序结果  31-34
    3.3 3’-RACE 片段的克隆及测序结果  34-37
    3.4 5’-RACE 片段的克隆及测序结果  37-40
    3.5 全长cDNA 序列的克隆及测序结果  40-43
    3.6 基因组DNA 序列的克隆及测序结果  43-44
    3.7 IRF-3 和IRF-7 基因的序列分析  44-54
      3.7.1 IRF-3 和IRF-7 cDNA 的序列和推断的氨基酸序列  44-45
      3.7.2 IRF-3 和IRF-7 的基因结构  45
      3.7.3 IRF-3 和IRF-7 的序列同源性比较  45-51
      3.7.4 IRF-3 和IRF-7 的系统进化分析  51-54
  4 讨论  54-56
第三章 大菱鲆 IRF-3 和 IRF-7 mRNAs 的组织分布研究  56-60
  1. 实验材料  56-57
    1.1 实验动物  56
    1.2 主要仪器与设备  56
    1.3 主要试剂及溶液的配制  56-57
  2 实验方法  57-58
    2.1 大菱鲆组织的获取  57
    2.2 总RNA 的提取及质量检测  57
    2.3 cDNA 第一链的合成  57
    2.4 引物设计  57-58
    2.5 PCR 分析与检测  58
  3 结果分析  58-59
  4 讨论  59-60
第四章 大菱鲆 IRF-3和IRF-7 基因应答大菱鲆红体病病毒 （TRBIV）感染的表达分析  60-67
  1 实验材料  60-61
    1.1 实验动物及病毒  60
    1.2 主要仪器与设备  60-61
    1.3 主要试剂及溶液配制  61
  2 实验方法  61-62
    2.1 大菱鲆红体病病毒感染大菱鲆鱼体  61
    2.2 总RNA 提取  61
    2.3 cDNA 第一链的合成  61
    2.4 Real-time PCR 检测与分析  61-62
  3 结果分析  62-65
  4 讨论  65-67
结论  67-68
参考文献  68-73
致谢  73-74
个人简历  74
学术论文  74

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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