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养殖鲆鲽类细菌性病原的鉴定及免疫的初步研究

作　者: 李珊珊
导　师: 黄倢；田黎
学　校: 青岛科技大学
专　业: 生物化工
关键词: 鲆鲽类 细菌鉴定 疫苗 ELISA抗体效价 免疫保护指数
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


随着大菱鲆为主体的鲆鲽类养殖产业规模的扩大和集约化程度的不断提高，病害日益严重，成为其生产发展的主要制约因素。2006年麦岛养殖牙鲆出现持续死亡，典型症状是体表或鳍基部溃烂，从病鱼体内分离到一株病原菌20060928-1，革兰氏阴性，直或弯短杆状，具极生单鞭毛，可运动，生理生化特征及16S rDNA序列分析菌鉴定为Vibrio harveyi。该菌感染牙鲆LD50为2.02×106 CFU／尾，药敏试验表明菌必治、头孢唑肟对其有较强的抑制作用。测定培养基初始pH、不同碳源对鳗弧菌生长的影响，利用均匀设计优化培养基配方，确定最佳培养条件初始pH为6.0，含NaCl 19‰，蛋白胨1.5％，蔗糖1.72％；选取4℃，0.40％福尔马林作用24 h作为其灭活条件，攻毒试验证实所制得疫苗是安全的。为了从特异性免疫方面评价疫苗的效果，建立了一种双抗原夹心ELISA检测大菱鲆血清抗体效价的方法，该法采用抗原包被微孔板，待血清样品中抗体与包被抗原形成特异性结合物后，再加入HRP标记的抗原，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，利用底物（OPD）显色。与凝集法相比，该法灵敏度较高，且不需要制备二抗，操作步骤简单。研究几种佐剂对大菱鲆的安全浓度范围，进行不同浓度梯度的浸浴免疫，四周后取其血清检测溶菌酶活力、蛋白含量及抗体效价，攻毒后计算免疫保护指数（PI），注射组PI为33.6，****含量为39.3mg╱L的浸浴组也有一定效果，其PI值为6.61。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
前言  9-17
  第一节 鲆鲽类主要细菌性病原及当前防治措施  9-13
    1 常见病原  9-12
      1.1 弧菌属病原  9-10
      1.2 链球菌病原  10-11
      1.3 气单胞菌属病原  11
      1.4 其它病原  11-12
    2 细菌性疾病的防治措施  12-13
      2.1 鱼苗的选择  12
      2.2 水质环境的优化  12
      2.3 饲料的选择  12
      2.4 药物的合理使用  12-13
      2.5 其他控制手段  13
  第二节 鱼用疫苗的研究现状  13-17
    1 疫苗的接种途径及影响因素  13-14
    2 疫苗开发的限制性因素  14-16
      2.1 细菌疫苗  14-15
      2.2 病毒疫苗  15-16
      2.3 寄生虫疫苗  16
    3 小结  16-17
第二章 养殖牙鲆哈维氏弧菌感染溃烂症研究  17-29
  第一节 病原菌的分离及致病性分析  17-19
    1 材料与方法  17-18
      1.1 试验用鱼  17
      1.2 试剂  17
      1.3 病原菌的分离培养  17
      1.4 人工感染试验  17-18
    2 结果  18-19
      2.1 患病症状  18
      2.2 病原菌和寄生虫  18
      2.3 人工感染实验  18-19
    3 讨论  19
  第二节 病原菌的鉴定及药物敏感实验  19-29
    1 材料与方法  20-21
      1.1 病原菌的形态观察  20
      1.2 病原菌生理特征测定  20
      1.3 病原菌生化特征测定  20
      1.4 病原菌16S rDNA序列测定  20-21
        1.4.1 PCR模板的制备  20
        1.4.2 16S rDNA序列的PCR扩增  20-21
        1.4.3 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳  21
        1.4.4 扩增产物的纯化和测序  21
      1.5 病原菌16S rDNA的系统发育学分析  21
      1.6 病原菌药物敏感实验  21
    2 结果  21-27
      2.1 形态特征  21-23
      2.2 病原菌的生理生化特征  23-24
      2.3 16S rDNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及序列测定  24-25
        2.3.1 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳  24
        2.3.2 扩增产物的序列测定  24-25
      2.4 16S rDNA的系发育树的构建  25-26
        2.4.1 构建16S rDNA系统发育树的16S rDNA序列  25-26
        2.4.2 16S rDNA序列系统发育树  26
      2.5 药物敏感试验  26-27
    3 讨论  27-29
第三章 鳗弧菌的优化培养及灭活条件的研究  29-38
  第一节 鳗弧菌优化培养和生长动态的研究  29-35
    1 材料与方法  29-30
      1.1 材料  29
      1.2 鳗弧菌菌株的复壮与分离  29-30
      1.3 LD_(50)的测定  30
      1.4 菌体产量的测定  30
      1.5 培养基初始pH对鳗弧菌生长的影响  30
      1.6 不同的碳源对鳗弧菌生长的影响  30
      1.7 培养基成份的不同配比对鳗弧菌生长的影响  30
      1.8 优化试验的结果  30
    2 结果  30-34
      2.1 鳗弧菌的复壮分离  30-31
      2.2 感染大菱鲆症状  31
      2.3 LD_(50)结果  31
      2.4 培养基初始pH对鳗弧菌生长的影响  31-33
      2.5 碳源对鳗弧菌生长的影响  33
      2.6 培养基成份的不同配比对鳗弧菌生长的影响  33-34
      2.7 优化结果验证试验  34
    3 讨论  34-35
  第二节 鳗弧菌灭活条件的探索  35-38
    1 材料与方法  35-36
      1.1 材料  35-36
      1.2 福尔马林对鳗弧菌的灭活试验  36
      1.3 鳗弧菌灭活疫苗的安全性评价  36
    2 结果  36-37
      2.1 鳗弧菌灭活试验  36
      2.2 鳗弧菌灭活疫苗的安全性评价  36-37
    3 讨论  37-38
第四章 双抗原夹心ELISA检测大菱鲆血清抗体效价方法的建立  38-46
  1 材料与方法  38-40
    1.1 试验材料  38
    1.2 抗原的制备及处理  38
    1.3 阳性和阴性血清的制备  38-39
    1.4 辣根过氧化物酶标记抗原产量的确定  39
    1.5 ELISA试验中包被抗原及标记抗原的最佳浓度确定  39-40
    1.6 竞争性抑制试验  40
    1.7 同微量凝集法敏感性的比较  40
  2 结果  40-44
    2.1 抗原的灭活效果及蛋白含量的测定  40
    2.2 标记抗原所需HRP的量的确定  40-41
    2.3 包被抗原及标记抗原最佳量的确定  41-43
    2.4 竞争性抑制试验  43-44
    2.5 与微量凝集法的比较  44
  3 讨论  44-46
第五章 大菱鲆浸浴免疫的初步研究  46-56
  第一节 各种添加剂浸浴急性毒性试验  46-49
    1 材料与方法  46-47
      1.1 试验用鱼与试剂  46
      1.2 试验方法  46-47
    2 结果  47-49
      2.1 SDS对大菱鲆的浸浴毒性试验  47
      2.2 OP-10对大菱鲆的浸浴毒性试验  47-48
      2.3 ****对大菱鲆的浸浴毒性试验  48
      2.4 大菱鲆对NaCl的耐受试验  48-49
      2.5 盐酸消旋山莨宕碱注射液对大菱鲆的毒性试验  49
    3 讨论  49
  第二节 大菱鲆浸浴免疫试验  49-56
    1 材料与方法  50-51
      1.1 试验用鱼与试剂  50
      1.2 免疫程序及样品的收集  50
      1.3 溶菌活力  50
      1.4 血清蛋白的浓度  50-51
      1.5 血清效价的测定  51
      1.6 攻毒试验  51
      1.7 统计分析  51
    2 结果  51-54
      2.1 溶菌酶活力比较  51
      2.2 血清总蛋白含量  51-52
      2.3 抗体效价比较  52
      2.4 攻毒结果  52-54
    3 讨论  54-56
结论  56-57
参考文献  57-63
附录  63-65
致谢  65-66
攻读期间发表学术论文  66-67

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
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