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辽宁碱蓬CMO基因启动子功能分析

作　者: 尹辉
导　师: 李秋莉
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: CMO基因启动子 5’端缺失分析盐诱导 Gus基因
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 114次
引　用: 4次
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内容摘要

胆碱单加氧酶(CMO)是合成甜菜碱的关键酶,甜菜碱是一种非毒性的渗透调节剂,在植物耐盐中起着重要的作用。CMO基因受盐诱导表达,随着环境中盐浓度的提高,CMO基因表达量增加。该基因的诱导表达特性一定与其启动子有关。本文对辽宁碱蓬CMO基因启动子进行了研究。研究CMO基因启动子对分析CMO基因表达调控机制具有一定的理论意义,获得盐诱导启动子区段,应用于植物基因工程,对提高转基因植物的耐盐性具有重要的应用价值。本文对辽宁碱蓬CMO基因启动子进行了系列片段缺失,系统研究了CMO基因启动子不同区段的功能,主要结果如下:1.对CMO基因启动子进行序列分析,发现该序列中除含有启动子基本元件以外,还含有三个盐诱导元件以及其它胁迫诱导元件。2.以双元载体pCAMBIAl301为基础,构建了含有全长及系列缺失启动子、以GUS基因为报告基因的系列表达载体,表达载体经PCR、酶切鉴定正确。3.利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,以潮霉素为选择标记,经PCR检测、GUS检测获得阳性植株,初步表明全长及缺失启动子片段已整合到烟草基因组中,且能驱动GUS基因的表达。4.GUS染色分析、荧光定量分析表明,在未受盐诱导时,各片段均能驱动GUS基因表达,但表达量不高;盐诱导后,GUS的活性明显提高,特别是pC5段,GUS活性是未诱导时的5倍,是35S启动子活性的2.4.倍,因此,可以认为,pC5段启动子可以行使启动子的功能,并且是一个盐诱导启动子。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-8
第一章文献综述  8-24
  1.1 启动子概述  8
  1.2 植物启动子的结构  8-11
    1.2.1 转录起始位点  8-9
    1.2.2 TATA 盒  9
    1.2.3 一般上游元件  9-11
    1.2.4 特有上游元件  11
  1.3 植物启动子分类及应用  11-19
    1.3.1 组成型启动子  12-13
    1.3.2 诱导型启动子  13-16
    1.3.3 组织特异性启动子  16-17
    1.3.4 启动子的人工改造及其应用前景  17-19
  1.4 启动子研究方法  19-21
    1.4.1 5′ 端缺失法  19-20
    1.4.2 内部缺失突变法  20
    1.4.3 衔接物扫描突变法  20-21
    1.4.4 定点突变法  21
  1.5 CMO 基因  21-24
第二章 CMO 基因启动子序列分析及缺失表达载体的构建  24-36
  2.1 实验材料  24
  2.2 实验方法  24-30
    2.2.1 CMO 基因启动子序列分析  24
    2.2.2 CMO 基因启动子5’端缺失序列的获得  24-28
    2.2.3 各缺失片段与 GUS 基因融合表达载体的构建  28-30
      2.2.3.1 各缺失片段及pCAMlBIA1301 质粒的双酶切  28
      2.2.3.2 酶切产物的回收  28-29
      2.2.3.3 各缺失片段与载体片段的连接  29
      2.2.3.4 连接产物的转化  29-30
      2.2.3.5 转化产物的检测  30
  2.3 结果与分析  30-35
    2.3.1 C M O 基因启动子序列分析  30-32
    2.3.2 CMO 基因启动子5’端缺失序列的获得  32-33
    2.3.3 各缺失片段与 GUS 基因融合表达载体的构建  33-35
    2.3.4 PC R 检测及酶切检测  35
  2.5 小结  35-36
第三章启动子缺失片段载体转化烟草及转基因烟草的检测  36-44
  3.1 实验材料  36
  3.2 实验方法  36-39
    3.2.1 工程菌的构建  36-37
      3.2.1.1 农杆菌感受态细胞的制备  36-37
      3.2.1.2 冻融法转化农杆菌  37
      3.2.1.3 工程菌的鉴定  37
    3.2.2 农杆菌介导转化烟草  37-38
      3.2.2.1 转化用烟草叶片的预培养  37
      3.2.2.2 农杆菌的培养  37
      3.2.2.3 浸染  37-38
      3.2.2.4 抗性芽的筛选及转基因植株在 Hv 中的生根培养  38
    3.2.3 转基因烟草的检测  38-39
      3.2.3.1 PCR 检测  38-39
      3.2.3.2 GUS 组织化学染色检测  39
  3.3 结果  39-42
    3.3.1 工程菌的构建  39-40
    3.3.2 农杆菌介导转化烟草  40
    3.3.3 转基因烟草的检测  40-42
  3.4 讨论  42-43
    3.4.1 关于农杆菌转化效率  42-43
    3.4.2 关于转基因烟草总 DN A 的提取  43
    3.4.3 关于 PCR 检测中 Taq 酶的选用  43
  3.5 小结  43-44
第四章 CMO 基因启动子不同区段盐诱导功能分析  44-50
  4.1 实验材料  44
  4.2 实验方法  44-47
    4.2.1 转基因烟草无菌苗的培养  44
    4.2.2 转基因烟草的盐处理  44
    4.2.3 GUS 组织化学分析与荧光定量分析  44-47
  4.3 实验结果  47-48
    4.3.1 组织化学分析结果  47
    4.3.2 GUS 酶活性的定量测定结果  47-48
  4.4 讨论  48-49
  4.5 结论  49-50
参考文献  50-55
附录  55-57
致谢  57-58

辽宁碱蓬CMO基因启动子功能分析

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