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猪圆环病毒2型ORF2基因在昆虫杆状病毒表达系统的表达及亚单位疫苗的初步研究

作　者: 张家明
导　师: 张许科
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪圆环病毒2型 ORF2基因 Cap蛋白杆状病毒亚单位疫苗免疫原性 kozak序列
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2)不仅是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,而且还与猪皮炎与肾病综合征((PDNS)、猪先天性振颤(CT)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪增生性和坏死性肺炎(PNP)、母猪繁殖障碍等疾病的发生密切相关。该病毒在世界各国蔓延,猪群的感染率非常高,主要侵害免疫系统,导致免疫机能下降,从而容易造成其它疾病的暴发。PCV2已成为当前危害养猪业最严重的病原之一,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国自2000年检测到PCV2后,该病毒在我国猪群的感染率一直呈上升趋势,已严重影响了我国养猪业的发展。由于PCV2在细胞上的增殖滴度非常低,所以开发传统灭活疫苗和弱毒疫苗难度很大,因此利用基因工程方法获得安全、高效、廉价的新型疫苗成为PCV2疫苗研制的重要方向。ORF2基因编码的Cap蛋白为PCV2的主要结构蛋白,Cap蛋白具有良好的免疫原性,ORF2基因是PCV2基因工程疫苗研究中的焦点。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统对PCV2 ORF2基因进行表达,并在外源基因的5`端引入Kozak序列,提高了Cap蛋白的表达量,为Cap蛋白作为PCV2亚单位疫苗的研究奠定了基础。根据Genbank发表的PCV2基因序列(AY686764),设计合成一对引物,PCR扩增PCV2 ORF2及其外侧区域基因,测序结果与PCV2基因序列(AY686764)完全一致。根据测序结果针对ORF2基因设计三对引物,分别对ORF2基因进行PCR扩增,并克隆到供体质粒pFastBacΙ,构建重组供体质粒pFastBac-ORF2,然后转化DH10Bac大肠杆菌,获得重组杆粒,再转染sf9昆虫细胞后传代,获得的重组杆状病毒,分别命名为VBac-P22、VBac-KP22和VBac-KGP22,再分别感染sf9昆虫细胞进行目的蛋白的表达。间接免疫荧光、SDS?PAGE和western blotting的鉴定结果表明:重组杆状病毒VBac-P22、VBac-KP22和VBac-KGP22均能在sf9昆虫细胞中有效表达目的蛋白;小鼠ELISA抗体检测结果显示:三种重组杆状病毒表达的目的蛋白所制备的亚单位疫苗免疫小鼠,均能刺激小鼠产生特异性抗体,证明三种重组杆状病毒表达的目的蛋白均具有良好的免疫原性;目的蛋白表达量的检测结果显示:三种重组病毒均以MOI=3感染相同培养条件下的sf9昆虫细胞,通过Bandscan和紫外分光光度计测定,VBac-KP22的目的蛋白表达量为0.91mg/108cells、VBac-KGP22的目的蛋白表达量为0.56mg/108cells、VBac-P22的目的蛋白表达量为0.24mg/108cells,结果证明在ORF2基因的5`端引入kozak序列提高了重组杆状病毒对Cap蛋白的表达量。

全文目录

致谢  4-6
摘要  6-7
1 文献综述  7-17
  1.1 病毒的发现  7
  1.2 病毒的病原特征  7-8
  1.3 病毒基因组结构  8-9
  1.4 病毒基因组编码的主要蛋白  9-10
  1.5 PCV2 的致病性  10-13
  1.6 PCV2 诊断方法  13-15
  1.7 PCV2 的防制  15
  1.8 杆状病毒表达系统简介  15-17
2 引言  17-18
3 材料与方法  18-31
  3.1 试验材料  18-22
  3.2 试验方法  22-31
4 结果与分析  31-40
  4.1 PCV2 ORF2 及其外侧区域基因的PCR 扩增  31
  4.2 重组质粒pT-P2 的构建  31-32
  4.3 重组质粒pT-P2 的测序鉴定  32
  4.4 重组供体质粒的构建和鉴定  32-35
  4.5 重组杆粒的构建和鉴定  35
  4.6 重组病毒的获得和鉴定  35-38
  4.7 SDS-PAGE 电泳  38
  4.8 western blotting 鉴定  38-39
  4.9 三种重组病毒蛋白表达量的测定  39-40
  4.10 亚单位疫苗免疫小鼠间接 ELISA 抗体检测  40
5 结论与讨论  40-43
  5.1 讨论  40-42
  5.2 结论  42-43
参考文献  43-49
英文摘要  49-51
附录  51-55

猪圆环病毒2型ORF2基因在昆虫杆状病毒表达系统的表达及亚单位疫苗的初步研究

内容摘要

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