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家蚕几种尿苷二磷酸—葡萄糖基转移酶的基因表达与功能研究

作　者: 王猛
导　师: 徐世清；司马杨虎
学　校: 苏州大学
专　业: 发育生物学
关键词: 家蚕 尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 糖基化反应 RNAi
分类号: S881.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


家蚕(Bombyx mori)天然有色蚕茧分为红黄茧系和黄绿茧系两大类。决定黄红茧系茧色的色素主要来自桑叶中的胡萝卜素(β-胡萝卜素、新生β-胡萝卜素等)和叶黄素类色素(叶黄素、蒲公英黄质、紫黄质、次黄嘌呤黄质等),而黄绿茧系的色素主要为黄酮类化合物。家蚕从桑叶中摄入的黄酮类化合物,需要在体内进行化学修饰之后方能显现出绿茧色,但绿茧色的形成以及黄酮类色素的化学修饰分子机理,特别是基因调控机理目前还不清楚。尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶(UGTs)是一群广泛分布于动物、植物、细菌以及病毒,与糖基化有关的蛋白酶超家族。该类酶催化核苷酸的糖基转移到受体分子的糖苷配基上,从而使受体分子从疏水性转变成亲水性。昆虫利用UGT酶的糖基化作用降解食物中的有毒植物化学物质,以抵抗食物有毒成分对机体造成的危害,UGT酶甚至还与杀虫剂的抗药性有关。家蚕等昆虫从植物摄取的黄酮类化合物在体内需要经过一系列如UGT酶参与的糖基化作用等化学修饰,而家蚕茧层中的黄酮类化合物分子结构也与桑叶中的黄酮类化合物明显不同,家蚕从桑叶摄取的一类黄酮类化合物槲皮素,先在中肠生成5-氧糖苷槲皮素,后在丝腺生成4’5’-双氧糖苷槲皮素。已知家蚕绿色茧的茧色形成主要由黄酮化合物的含量所决定,可以推测,UGT酶的基因家族可能与黄酮类色素在家蚕体内的转移,以及蚕茧的成色有关。家蚕是鳞翅目模式生物,其天然有色茧是具有重大应用前景的遗传资源。由于家蚕茧色受多基因调控,遗传机制了解不详,挖掘和研究茧色调控基因是被公认的有效突破口之一。本文依靠家蚕基因组数据库资源,利用分子克隆、RACE、RNAi、bac-to-bac昆虫细胞表达等技术手段,对鳞翅目模式昆虫家蚕的葡萄糖基转移酶基因的表达模式和功能进行了研究,希望进一步揭示UGT基因的功能,以及家蚕茧色的形成机理,为茧色分子标记和分子设计育种提供帮助,主要结果如下:1.首次在家蚕中克隆出4种尚未克隆的葡萄糖基转移酶基因,包括UGT013830(UGT30)、UGT013834(UGT34)、UGT013859(UGT59)、UGT013860(UGT60)基因。利用RACE技术成功的克隆出UGT30基因的全长cDNA,其长度为2136bp(登录号为:HQ833816)。根据已有报道,选取了7种在中肠和丝腺中表达量较高的UGT基因,包括UGT30、UGT34、UGT59、UGT60、UGT013865(UGT65)、UGT010286(UGT86)和UGT010289(UGT89),对其中一些基因做了时空表达的调查。2.为了研究UGT酶对家蚕茧色的影响,用RT-PCR方法对以上7种基因在白茧品种C108和皓月、绿茧品种大造和G1、黄茧品种Y12和黄茧限性品种Ys的丝腺、中肠和生殖腺组织中的表达进行了定性与定量分析。结果显示,UGT30、UGT86和UGT89具有绿茧品种特异性表达,可能与绿茧色形成有关,而UGT30在不同茧色品种还存在mRNA转录本的差异。3.进一步阐明这些UGT基因的作用,我们选取了UGT30,具有绿茧品种特异性表达的基因,以体外转录合成长链dsRNA,并优化了注射家蚕体内的浓度。由于dsRNA注射的有效时间是36-72 h,我们采取在大造品种5龄期间共两次注射5μg/dsRNA。家蚕在注射dsRNA UGT30后,出现死亡率增加、发育变缓。可能是由于家蚕发育过程中UGT30蛋白对于物质在体内代谢的起到重要的作用,UGT30基因表达量下调将导致家蚕体质变弱,不能正常生长。另外,检测注射前后丝腺和中肠总黄酮含量,结果显示总黄酮含量在注射前后几乎未发生改变。而后我们又采用Real time PCR方法,选取了UGT30和UGT86基因,对家蚕5龄幼虫不同组织中的转录水平以及蜕皮激素和植物次生代谢物诱导下5龄幼虫不同组织中的转录水平进行了测定。4.以Bac-to-Bac杆状病毒感染的Sf9昆虫表达系统获得了大量高活性UGT86和UGT30重组蛋白;将重组后的粘粒与阳离子脂质体结合后转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,感染Sf9细胞72h后收集蛋白,采用RT-PCR和Western-blot进行蛋白表达鉴定,并进一步以槲皮素为底物,对UGT86和UGT30重组蛋白进行了酶活性调查。在含有UDP-glucose的葡萄糖体外孵育系统中,用高效液相色谱法分析鉴定,只有UGT86重组蛋白能够代谢槲皮素产生槲皮素葡萄糖苷的代谢产物。可以看出,UGT86重组酶可以使槲皮素等黄酮物质发生糖基化反应,可能与黄酮物质体内代谢有关。

全文目录


中文摘要  4-7
Abstract  7-14
第一章 文献综述  14-31
  1 UGTs 与糖基化作用  14-22
    1.1 UGTs 的概况  14-16
    1.2 糖基化作用与底物类型  16-19
    1.3 重组UGT 酶的体外表达  19-22
  2 UGTs 与家蚕天然有色茧  22-31
    2.1 家蚕有色茧中的主要色素物质  23-27
    2.2 黄绿茧系茧色形成机理的探究  27-29
    2.3 天然有色茧丝资源的特性及开发应用前景  29-31
第二章 研究目的与内容  31-33
  1 目的与意义  31
  2 研究内容  31-32
  3 技术路线图  32-33
第三章 主要试剂与常用试验方法  33-45
  1 常用材料与试剂  33-35
    1.1 菌种、细胞系与蚕品种  33
    1.2 分子生物学试剂  33
    1.3 培养基  33
    1.4 缓冲液和常用溶液  33-35
    1.5 核酸电泳相关试剂  35
    1.6 生物信息学资源及分析软件  35
  2 主要仪器设备  35-36
  3 常用实验方法  36-45
    3.1 总RNA 的提取及cDNA 的制备  36-37
    3.2 PCR 产物的回收  37
    3.3 DNA 琼脂糖凝胶电泳  37-38
    3.4 连接反应  38
    3.5 感受态细胞制备  38
    3.6 连接产物的转化  38
    3.7 重组质粒的筛选  38
    3.8 质粒的提取（抽裂解法）  38-39
    3.9 实时定量PCR（Real time PCR）  39
    3.10 细胞传代培养的基本操作  39-41
    3.11 杆状病毒表达蛋白  41-43
    3.12 BCA（bicinchoninicacid，二辛可酸）法侧定蛋白浓度  43
    3.13 SDS-PAGE 电泳  43
    3.14 Western blotting  43-45
第四章 家蚕几种尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶基因的茧色品种差异表达  45-54
  1 材料与方法  45-47
    1.1 蚕品种  45-46
    1.2 试验试剂与仪器  46
    1.3 总RNA 提取  46
    1.4 引物设计  46
    1.5 竞争性RT-PCR检测  46-47
  2 结果与分析  47-52
    2.1 UGT 基因表达的组织特异性  47-49
    2.2 UGT 基因的表达量差异  49-51
    2.3 UGT30 在不同茧色品种的转录本差异  51-52
  3 讨论  52-54
第五章 家蚕几种UGT 基因的表达规律及功能研究  54-75
  1 材料与方法  54-58
    1.1 材料  54-55
    1.2 实验方法  55-58
  2 结果与分析  58-72
    2.1 UGT30 的克隆、表达模式及功能研究  58-68
    2.2 UGT86 和UGT89 的克隆及表达模式  68-72
  3 讨论  72-75
    3.1 茧色特异候选基因UGT30、UGT86 和UGT89 的克隆与时空表达调查  72-73
    3.2 家蚕UGT30 的功能验证  73-75
第六章 家蚕UGT 基因的真核表达和活性测定  75-85
  1 材料与方法  75-77
    1.1 实验材料  75
    1.2 重组 UGT 的表达操作步骤  75-76
    1.3 糖基化作用体外孵育方法  76
    1.4 槲皮素的HPLC 分析条件  76-77
  2 实验结果  77-82
    2.1 UGT30 和UGT86 正确基因序列的克隆及测序  77
    2.2 重组转座载体的构建和鉴定  77-78
    2.3 重组杆状病毒粘粒（Bacmid）的获得和鉴定  78
    2.4 重组杆状病毒感染 sf9 细胞  78-79
    2.5 RT-PCR 鉴定转染的细胞在mRNA 分子水平上的转录情况  79-80
    2.6 Western blotting 检测表达的目的蛋白  80-81
    2.7 UGT30 和UGT86 重组蛋白的活性检测  81-82
  3 讨论  82-85
    3.1 杆状病毒表达系统可用于UGT 酶的活性检测  82-83
    3.2 家蚕UGT 酶的底物活性及其生理作用  83-85
第七章 综合结论  85-88
  1 主要结论  85-86
    1.1 家蚕中一些UGT 基因具有家蚕茧色品种间特异性  85
    1.2 UGT30、UGT86 和UGT86 具有组织和发育时期特异性  85-86
    1.3 UGT30 基因在家蚕生长发育期间发挥重要作用  86
    1.4 家蚕UGT86 蛋白使槲皮素发生糖基化反应  86
  2 进一步研究方向  86-88
参考文献  88-96
在学期间的论文及和学术成果  96
攻读学位期间参与的科研项目  96-97
附录  97-107
致谢  107-108

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 蚕桑 > 蚕基础科学 > 蚕的生理、遗传、生态、生物物理、生物化学
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