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家蚕一种hAT家族转座酶基因的分析

作　者: 沈小绢
导　师: 汪生鹏
学　校: 江苏科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕转座子原核表达系统实时定量PCR 重组杆状病毒
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

转座子是基因组中一段特异的具有转位特性的独立DNA序列。长期以来,人们认为它们是遗传物质中的无用部分。但是现在越来越清楚地知道转座子能导致一些对适应性和生物存活有利的变化。BmhAT基因的发现和分析对于进一步研究家蚕转座子的结构及性质具有重要的作用,也对家蚕基因组序列的复杂性有了更深一步的理解。本论文首先通过生物信息学方法,对BmhAT的基因序列及蛋白结构域进行了分析。发现BmhAT与许多转座酶在序列上有较高的同源性,具有hAT家族转座酶所特有的三个保守区域,分别是Zf-BED、DUF-659和hAT二聚化结构域;同时采用荧光实时定量PCR方法,在DNA水平测定其拷贝数,发现BmhAT在几个家蚕品种以及野蚕的基因组中都存在多个拷贝,其中在法403中最高,P50中最低,这可能与转座子的可移动特性有关;利用荧光实时定量RT-PCR方法在mRNA水平上测定BmhAT基因在家蚕不同组织中的相对表达量,发现BmhAT在脂肪体和后部丝腺中均存在表达,表达量分别约是参照基因A3的0.6倍和0.4倍。通过对BmhAT的定量分析,为后面进一步研究BmhAT蛋白的特性及表达提供了有利的条件。其次,通过大肠杆菌系统大量表达BmhAT融合蛋白,利用Ni+-NTA亲和层析等技术对该蛋白纯化进行了初步探索。结果发现BmhAT蛋白能在大肠杆菌中正确表达,但只有少量与Ni+-NTA柱结合,这可能与蛋白质本身的结构及性质有关。利用生物信息学方法进行蛋白抗原表位预测及抗原多肽设计,将片段截短成BmhAT1,从而进行蛋白表达纯化条件的初步摸索。首先采用DEAE阴离子交换柱进行初步纯化,然后使用Ni+-NTA柱进行再次纯化,最终获得了纯度较高的蛋白质。通过对截短后蛋白表达与纯化的分析,有利于制备抗体进一步检测其在家蚕成体的真实表达。最后,采用BmNPV的Bac-to-Bac重组杆状病毒表达系统对BmhAT蛋白在BmN培养细胞和家蚕成体中进行了表达。结果发现,BmhAT蛋白能正常表达,但基本停留在培养细胞或家蚕血细胞内,很少能分泌到细胞培养基或者家蚕血淋巴中。利用橙色荧光蛋白OFP报告基因对BmhAT蛋白进行细胞内的核定位分析,在细胞的核心区看到了明显的荧光,说明BmhAT可能是一个核蛋白。通过对BmhAT蛋白在蚕体内表达的研究,为以后进一步分析蛋白质的高级结构奠定基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
第1章绪论  13-19
  1.1 研究背景和选题意义  13-17
    1.1.1 hAT 家族转座子  13
    1.1.2 家蚕转座子的研究进展  13-14
    1.1.3 实时定量PCR  14-15
    1.1.4 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统  15-17
  1.2 本文的主要内容  17-19
第2章家蚕转座酶基因BmhAT 的定量分析  19-31
  2.1 引言  19-20
  2.2 材料与方法  20-23
    2.2.1 实验材料  20-22
    2.2.2 实验方法  22-23
  2.3 结果与分析  23-29
    2.3.1 BmhAT 的生物信息学分析  23-26
    2.3.2 Real-Time PCR 扩增曲线及熔解曲线  26-27
    2.3.3 BmhAT 在基因组中的拷贝数  27-28
    2.3.4 BmhAT 基因在家蚕染色体中的分布  28
    2.3.5 BmhAT 基因相关cDNA 序列分析  28-29
    2.3.6 BmhAT 基因在家蚕中的相对表达量  29
  2.4 讨论  29-30
  2.5 本章小结  30-31
第3章家蚕转座酶BmhAT 在大肠杆菌中的表达与纯化  31-53
  3.1 引言  31
  3.2 材料与方法  31-40
    3.2.1 实验材料  31-35
    3.2.2 实验方法  35-40
  3.3 结果与分析  40-51
    3.3.1 BmhAT 基因表达载体的构建  40-42
    3.3.2 不同菌株对表达结果的影响  42-43
    3.3.3 BmhAT 基因的原核表达与纯化  43-51
  3.4 讨论  51-52
  3.5 本章小结  52-53
第4章重组转座酶BmhAT 在BmN 培养细胞及家蚕中的表达  53-67
  4.1 引言  53
  4.2 材料与方法  53-57
    4.2.1 实验材料  53-54
    4.2.2 实验方法  54-57
  4.3 结果与分析  57-64
    4.3.1 BmhAT 基因相关重组 Bacmid 的获得及鉴定  57-61
    4.3.2 BmhAT 蛋白在 BmN 培养细胞中的表达  61-62
    4.3.3 BmhAT 蛋白在家蚕血淋巴中的表达  62-63
    4.3.4 BmhAT 蛋白的亚细胞定位  63-64
  4.4 讨论  64-65
  4.5 本章小结  65-67
结论  67-69
参考文献  69-73
攻读学位期间发表的学术论文  73-75
致谢  75-76
大摘要  76-80

家蚕一种hAT家族转座酶基因的分析

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