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纳豆激酶基因的克隆及表达研究

作　者: 张霞
导　师: 林建强
学　校: 山东大学
专　业: 发酵工程
关键词: 纳豆激酶基因克隆表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 307次
引　用: 1次
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内容摘要

纳豆是日本传统的发酵食品，在日本已经有两千年的历史。1987年日本的Sumi H等从纳豆中分离出了一种具有纤溶活性的蛋白激酶，称之为纳豆激酶(nattokinase，NK)。它由枯草牙孢杆菌产生，为碱性丝氨酸蛋白酶，因其具有很强的溶血栓能力，具有安全性好、半衰期长、口服有效等优点而受到了广泛的关注。纳豆激酶由275个氨基酸组成，根据其氨基酸序列顺序计算出该酶的相对分子质量为27 728。前纳豆激酶原(pre-pro-NK)组成为381个氨基酸，在分泌过程中切除N端106个氨基酸残基而形成275个氨基酸的成熟分子。纳豆激酶等电点为8.6±0.3。在自然pH状态和自然温度下，该酶相对比较稳定。近年来，国内外学者对纳豆激酶的基因序列和生理生化特性进行的一系列研究表明，纳豆激酶可被开发成为一种新型的溶栓药物。纳豆激酶是目前发现的100多种具有口服纤溶作用的物质中最具潜力的纤溶蛋白酶。目前，国内外一方面通过改良菌种和优化纳豆生产工艺等方法来提高纳豆中纳豆激酶活性，另一方面也进行了许多对纳豆杆菌液体发酵条件、纳豆激酶的纯化等方面有研究。本实验从枯草杆菌(纳豆株)中提取基因组DNA，聚合酶链式反应(PCR)扩增分别获得1072bp和1194bp的DNA片段，将基因片断克隆到pMD18-T载体上，筛选重组子，通过限制性内切酶、PCR技术和测序分析确定该重组子所含插入片段为纳豆激酶基因。利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体pET22b-nk和pGEX-4T-1-nk，转化E.coli BL21(DE3)后在大肠杆菌中表达，为纳豆激酶快速高效表达进一步奠定基础。

全文目录

目录  4-8
摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
缩略语  11-12
第一章、绪论  12-17
  1.1 纳豆和纳豆激酶简介  12-17
    1.1.1 纳豆  12
    1.1.2 纳豆激酶  12-15
      1.1.2.1 纳豆激酶的生化特性  12-13
      1.1.2.2 纳豆激酶的基因结构  13-14
      1.1.2.3 纳豆激酶的溶栓机理  14
      1.1.2.4 纳豆激酶的研究现状及应用前景  14-15
    1.1.3 本实验论文的研究内容  15-17
第二章、纳豆激酶基因扩增及克隆  17-33
  2.1 材料与方法  17-24
    2.1.1 材料  17-18
      2.1.1.1 质粒与菌株  17
      2.1.1.2 试剂与工具酶  17
      2.1.1.3 主要仪器  17
      2.1.1.4 引物设计与合成  17-18
    2.1.2 实验方法  18-24
      2.1.2.1 枯草杆菌全基因组DNA的提取  18-19
      2.1.2.2 目的基因的扩增  19-21
      2.1.2.3 目的基因克隆  21-22
      2.1.2.4 重组质粒的筛选  22-23
      2.1.2.5 重组质粒的验证  23-24
        2.1.2.5.1 重组质粒的酶切验证  23-24
        2.1.2.5.2 重组质粒的PCR验证  24
        2.1.2.5.3 测序分析  24
  2.2 结果与讨论  24-33
    2.2.1 基因扩增  24-26
    2.2.2 重组质粒的酶切验证  26-28
      2.2.2.1 重组质粒的构建图谱  26-27
      2.2.2.2 重组质粒的酶切验证  27-28
    2.2.3 重组质粒的PCR验证  28-30
      2.2.3.1 重组质粒PMD18-T-nk1的PCR验证  28-29
      2.2.3.2 重组质粒PMD18-T-nk2的PCR验证  29-30
    2.2.4 重组质粒的测序分析  30-33
第三章、重组表达载体构建  33-39
  3.1 材料与方法  33-34
    3.1.1 材料  33
      3.1.1.1 菌株与质粒  33
      3.1.1.2 试剂与工具酶  33
      3.1.1.3 主要仪器  33
    3.1.2 实验方法  33-34
      3.1.2.1 pET22B-nk1的构建  33-34
      3.1.2.2 pET22B-nk2的构建  34
      3.1.2.3 pGEX-4T-1-nk2的构建  34
  3.2 结果与讨论  34-39
    3.2.1.1 pET22B-nk1的构建图谱  34-35
    3.2.1.2 pET22B-nk1的酶切验证  35
    3.2.2.1 pET22B-nk2的构建图谱  35
    3.2.2.2 pET22B-nk2的酶切验证  35-37
    3.2.3.1 pGEX-4T-1-nk2的构建图谱  37
    3.2.3.2 pGEX-4T-1-nk2的酶切验证  37-39
第四章、重组菌的生长曲线、稳定性检测及外源基因的活性表达  39-51
  4.1 材料与方法  39-41
    4.1.1 主要仪器  39
    4.1.2 实验方法  39-41
      4.1.2.1 重组菌的生长曲线测定  39
      4.1.2.2 重组菌的稳定性检测  39
      4.1.2.3 外源基因的表达  39-41
        4.1.2.3.1 诱导培养  39
        4.1.2.3.2 纤维蛋白平板法检测纤溶活性  39-41
          方法一:传统单剂量法  40
          方法二:本实验新改进二剂量法  40-41
  4.2 结果与讨论  41-51
    4.2.1 重组菌的生长曲线  41-43
    4.2.2 质粒稳定性  43-44
    4.2.3 纤溶活性  44-51
      4.2.3.1 单层平板法测定纤溶活性  44-51
        单剂量法原理及公式推导  45-47
        二剂量法话计算公式推导  47-51
总结  51-52
参考文献  52-54
硕士在读期间发表的文章  54-55
致谢  55-56
学位论文评阅及答辩情况表  56

纳豆激酶基因的克隆及表达研究

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