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青岛文昌鱼谷丙转氨酶基因克隆、表达和功能研究

作　者: 荆晓丽
导　师: 张士璀
学　校: 中国海洋大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 文昌鱼 Amphialt基因克隆表达抗菌活性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)又称为丙氨酸转移酶(alanine transminase,或glutamic pyruvic transaminase, GPT),系统名为L-丙氨酸：α-酮戊二酸转氨酶(L-alanine:a-oxoglutarate aminotransferase),酶编号:EC2.6.1.2,ALT是天冬氨酸转氨酶家族的成员之一,其是一类磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)依赖性转氨酶。ALT催化丙氨酸和α-酮戊二酸转氨生成丙酮酸和谷氨酸可逆反应,这一催化过程需磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶来完成。近年来,在动植物中对于ALT基因、蛋白的结构和功能研究都取得了一定程度的进展,特别是在哺乳动物人、鼠等中已有非常系统的研究。但是,关于文昌鱼谷丙转氨酶的研究却仅限于蛋白水平的定位等研究。文昌鱼是无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡类群的典型代表,一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的模式动物。本文克隆了青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicus)的具有完整开放阅读框的ALT的基因(Amphialt),并对其结构、进化、表达和功能进行了研究。首先,我们从头索动物文昌鱼中克隆出谷丙转氨酶基因(Amphialt)并对其序列进行了分析。其最大开放阅读框编码500个氨基酸的蛋白质(理论分子量为54.9 kDa),没有N末端信号肽。该cDNA编码的蛋白AmphiALT,具有保守的AAT like结构域。这与脊椎动物及无脊椎动物中的谷丙转氨酶都极为相似,均属于转氨酶家族中的第一类天冬氨酸转氨酶亚家族。将AmphiALT的保守结构域同其他ALT进行序列比对发现,该蛋白与各物种中ALT的同源性较高,特别是保守结构区的催化残基Lys位点和6个磷酸吡哆醛结合位点都很保守,说明他们可能具有相似的三级结构。系统进化分析结果显示AmphiALT和佛罗里达文昌鱼及海鞘的ALT独聚一支,位于脊椎动物的基部,是从无脊椎到脊椎动物ALT的中间过渡类型,脊椎动物的ALT1和ALT2异构酶分别聚类,提示文昌鱼AmphiALT基因可能是脊椎动物ALT]和ALT2异构酶基因的原始祖型。其次,我们对alt基因在青岛文昌鱼中的表达情况做了研究。Northern blot结果显示,Amphialt基因在青岛文昌鱼的肝盲囊、后肠及性腺等组织中的转录产物为一条带,大小为2370bp左右,与我们从文昌鱼中克隆的Amphialt cDNA的大小基本一致。切片原位杂交分析表明,Amphialt在成体文昌鱼组织中呈特异性表达,在肝盲囊和后肠中的表达量最高。用细菌外毒素(LPS, LTA)刺激文昌鱼肝盲囊显示,在革兰氏阴性菌细胞壁成分(LPS)刺激后,肝盲囊中Amphialt基因表达水平在6至24小时显著升高。因此,推测文昌鱼Amphialt可能是一种免疫防御相关分子,参与宿主免疫防御。为了在蛋白水平上验证文昌鱼AmphiALT是否参与宿主免疫,我们构建了原核表达载体,表达并纯化出重组蛋白AmphiALT,复性后对其进行酶活测定及功能检测。结果检测到复性后的重组AmphiaALT相对较低的催化活性(0.114±0.02 U/mg),抗菌活性检测发现它对革兰氏阴性细菌大肠杆菌有显著的抑制作用,对其抑菌机理的进一步研究发现重组AmphiALT可与大肠杆菌结合并破坏菌体表面,并且ELISA结果显示其可能是通过与细菌表面的LPS结合,进而导致细菌溶解。这说明AmphiALT是一种免疫相关蛋白。另一方面,这些结果也支持了文昌鱼的肝盲囊与脊椎动物肝脏同源的观点,它们都是急性时相反应的主要组织。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章文献综述  11-23
  1 模式动物文昌鱼概述  11-17
    1.1 文昌鱼的发现、种类和命名  11-12
    1.2 文昌鱼的生活习性和胚胎发育  12-14
    1.3 文昌鱼的形体结构  14-17
  2 谷丙转氨酶  17-20
    2.1 谷丙转氨酶的命名及分类  17-18
    2.2 谷丙转氨酶的生物学功能  18-19
    2.3 谷丙转氨酶的研究进展  19-20
  3 本文的研究目的及采用的技术路线  20-23
    3.1 研究目的  20-22
    3.2 技术路线  22-23
第二章文昌鱼Amphialt基因的克隆、表达和功能研究  23-86
  1 前言  23
  2 材料与方法  23-66
    2.1 文昌鱼Amphialt基因全长cDNA序列的克隆  23-35
    2.2 序列与系统进化分析  35
    2.3 分组织Northern blot  35-42
    2.4 切片原位杂交检测Amphialt基因在成体文昌鱼组织中的表达  42-45
    2.5 文昌鱼Amphialt基因功能的初步探讨  45-48
    2.6 重组蛋白pET28a/Amphialt原核表达  48-60
    2.7 改良赖氏法测定重组AmphiALT酶活性  60-63
    2.8 重组蛋白AmphiALT抗菌活性的检测  63
    2.9 扫描电镜实验  63
    2.10 重组AmphiALT与细菌的结合  63-65
    2.11 ELISA实验  65-66
  3 结果  66-84
    3.1 Amphialt基因全长cDNA序列的克隆  66-68
    3.2 序列与系统进化分析  68-71
    3.3 Northern blot和切片原位杂交分析Amphialt在成体组织中的表达  71-74
    3.4 Amphialt基因功能的初步研究  74-76
    3.5 重组蛋白的原核表达  76-79
    3.6 重组AmphiALT酶活性的检测  79-80
    3.7 重组蛋白抑菌活性的检测  80-81
    3.8 FITC-labeled AmphiALT与各种菌的结合  81-82
    3.9 DIG-labeled AmphiALT与病原相关分子模式的结合  82-84
  4 总结与展望  84-86
参考文献  86-93
附录  93-94
缩略语  94-96
致谢  96-97
个人简历  97-98
发表的学术论文  98

青岛文昌鱼谷丙转氨酶基因克隆、表达和功能研究

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