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肺表面活性物质相关蛋白A1在甲醇酵母中的表达与纯化

作　者: 王霞
导　师: 封志纯
学　校: 第一军医大学
专　业: 儿科学
关键词: 肺表面活性物质相关蛋白Al（SP-Al）表达纯化大肠杆菌酵母吞噬肺巨噬细胞
分类号: R722.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

呼吸窘迫综合征(RDS)是导致早产儿死亡的主要因素并与一定的遗传背景有关。PS替代治疗是唯一有效的治疗手段。与RDS同样，肺表面活性物质(PS)的功能或成分的改变与其它呼吸系统疾病相关；如成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、特异性肺纤维化(IPF)和肺部感染。目前临床使用的PS主要为动物肺组织和人羊水中提取物，价格昂贵，不能满足临床的需要，因此人工合成磷脂和基因工程产物生产PS将是获得PS的最佳途径。 PS是由肺Ⅱ型细胞合成与分泌的一种脂蛋白复合物，肺表面活性物质相关蛋白(SP-A)是PS中含量最丰富的蛋白质，有多种生理功能。SP-A基因定位于染色体10q21-23，由两个功能基因SP-A1、SP-A2和一个假基因组成，两种基因在核苷酸水平有94％的同源性，基因产物有97％的同源性。SP-A单体由248个氨基酸组成，相对分子量约为26～38kDa。甲醇酵母作为单细胞真核生物，既具有大肠杆菌或酿酒酵母的繁殖快、易于培养和便于基因工程操作的特性，又具有高等真核表达系统的蛋白质折叠和翻译后加工功能。并且外源蛋白质表达水平高，还能分泌外源蛋白质到培养夜中，便于蛋白质的纯化。因此，最近十多年来，酵母作为一种基因工程表达系统受到广泛关注。本研究将正常中国人的SP-A1基因分别克隆至酵母分泌表达载体pPIC9K和胞内表达载体pPIC3.5K中，转化至甲醇营养型酵母Pichiapastoris系统，获得HIS+Mut+和HIS+Muts的重组体，经过G418抗性筛选，筛选出高拷贝重组体。以甲醇诱导，筛选高效表达的重组菌种。通过优化表达条件，目标产物在摇瓶发酵液中高效表达，可达200mg／L。将筛选到的高效表达的重组菌种转入发酵罐中高密度发酵、诱导表达，经过离心和超滤，得到粗提SP-A1，再经过凝胶过滤层析和高效液相色谱(HPLC)进一步纯化、鉴定，得到相对分子量约为32kDa的目的蛋白，表达量为 0．93g／L，纯度为 95q／o以上。本研究表达的SPAI具有免疫原性，可刺激小鼠产生抗SP叭抗体，并具有生物活性，可调理肺巨噬细胞吞噬病原体。

全文目录

缩略词表  4-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-20
第一部分 SP-A1在甲醇酵母（Pichia pastoris）中的分泌表达及产物的初步鉴定  20-38
第二部分 SP-A1在Pichia pastoris中的发酵表达、产物的纯化及活性分析  38-47
第三部分 SP-A1在Pichia pastoris中的胞内表达及产物的初步鉴定  47-56
结论  56-57
参考文献  57-62
综述  62-69
主要仪器设备  69-70
学习期间撰写和发表论文  70-71
致谢  71-72
附录：资助基金  72

肺表面活性物质相关蛋白A1在甲醇酵母中的表达与纯化

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