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蛋白ABIN1与μ阿片受体的作用及其功能影响研究

作　者: 王萧
导　师: 宫泽辉
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: A20结合核因子抑制蛋白蛋白相互作用阿片依赖
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

阿片类药物在中枢镇痛方面为临床常用药,具有镇痛、止咳、止泻、麻醉等药理作用,同时也具有较强的成瘾性和耐受性,长期应用后易产生依赖。这不仅限制了该类药物的临床应用,也导致了药物的滥用。长期以来,人们从各个方面入手研究阿片成瘾的机制,但都尚未阐明其关键所在,无法找到针对性的解决方案。随着分子生物学的发展,药物研发的重点逐渐从化合物的筛选向药物靶标转变,寻找并阐明与阿片受体相互作用的蛋白,观察其对依赖形成发展的影响,可能是一种有意义的探索。本实验室前期工作中,以μ阿片受体C-末端为诱饵蛋白,利用细菌双杂交技术筛选吗啡依赖大鼠的脑cDNA文库,得到19个阳性克隆。经过调研分析,选择其中的一个蛋白:A20结合核因子抑制蛋白(A20 bing inhibitor of NF-κB activation ,ABIN1)进行深入研究。ABIN1的生理功能是连接A20和NEMO/IKKγ,具有促进A20介导的NEMO/IKKγ去泛素化作用,因而抑制NF-kB的功能[1]。此外,ABIN1还是一个细胞死亡信号通路中负性调节蛋白的感受器,通过与多聚泛肽链结合来抑制细胞死亡和维持胚胎生长发育[2]。但ABIN1对神经系统及阿片类药物依赖性的影响迄今为止国内外尚未见报道。因为双杂交系统在进行蛋白相互作用研究时往往存在一定的假阳性,所以在进一步研究靶蛋白功能前,需要采用多种方法共同验证ABIN1和μ阿片受体之间的相互作用,在确定二者存在相互作用的基础上,再进行ABIN1的功能研究。实验方法:1、构建原核表达的重组质粒,利用IPTG诱导表达融合蛋白,通过pull-down实验验证ABIN1和μ阿片受体的体外相互作用。2、构建真核表达的重组质粒,利用脂质体介导的方法用质粒pcDNA3.1-myc- hisB-ABIN1 ( 367-636 ) / pcDNA3.1-myc-hisB-ABIN1 ( 380-636 )分别和pcDNA3.0-μ-HA瞬时共转染CHO细胞。通过免疫荧光共定位方法观察蛋白ABIN1(aa367-636)/ ABIN1(aa380-636)和μ阿片受体在细胞内的分布情况。通过免疫共沉淀方法验证蛋白ABIN1和μ阿片受体的细胞内相互作用。3、选用钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)偶联肽为抗原免疫新西兰大耳兔,制备蛋白ABIN1的多克隆抗血清,用以后续功能研究。4、在单转μ阿片受体的稳定细胞株CHO-μ-68基础上,构建共转染蛋白ABIN1和μ阿片受体的稳定细胞株,利用制备所得多克隆抗血清进行筛选,获得表达量高的共转稳定细胞株,用以后续功能研究。5、在成功制备共转稳定细胞株上,利用放射性受体配体结合实验观察ABIN1对μ阿片受体与配体结合力的影响。利用[35S]GTPγS实验观察ABIN1对μ阿片受体激动活性的影响。利用LANCE? cAMP 384 Kit检测ABIN1对DAMGO诱导的腺苷酸环化酶(cAMP)浓度变化的影响。实验结果:1、体外实验将μ阿片受体C-末端与GST融合,靶蛋白ABIN1与his融合,通过pull-down实验证明: GST-C能够特异性的沉淀his-hABIN1;反之,his-ABIN1能特异性的沉淀GST-C,而对GST无影响。说明在体外实验中, ABIN1与μ阿片受体C-末端存在相互作用。2、细胞内共定位实验结果表明,蛋白ABIN1(aa367-636)/ ABIN1(aa380-636)在胞浆内均呈弥散性分布,靠近细胞膜处亦有分布,与μ阿片受体在细胞内存在共定位现象,二者在空间上有结合的可能。免疫共沉淀实验结果进一步表明在非变性裂解的条件下,蛋白ABIN1(aa367-636)与μ阿片受体存在相互作用,为下一步研究蛋白ABIN1的功能提供了依据。3、选择ABIN1特异性片断,用人工合成的方法制备抗原,免疫新西兰大耳兔,三个月后收集血清,获得蛋白ABIN1的多克隆抗血清。利用ELISA、免疫荧光和western印迹检测共同鉴定所得抗血清的特异性,结果显示兔Ⅱ抗血清制备成功。4、构建共转染蛋白ABIN1和μ阿片受体的稳定细胞株,选用制备所得的兔Ⅱ抗血清作为一抗,利用western印迹检测鉴定阳性克隆,选择蛋白表达量相对较高的克隆,最终获得共转单克隆CHO-μ68-ABIN1-19和CHO-μ68-ABIN1-18两个细胞株,进行后续实验。5、用[3H]Diprenorphine进行放射性受体配体结合实验,观察ABIN1对μ阿片受体与配体结合力的影响。实验结果显示,对照组单转μ阿片受体的稳定细胞株CHO-μ-68,Kd值和Bmax值分别为(0.19±0.29)nmol/L、(1.71±0.75)pmol/mg蛋白。CHO-μ68-ABIN1-18细胞株和CHO-μ-68细胞株相比,未见明显变化。CHO-μ68-ABIN1-19细胞株和CHO-μ-68细胞株相比,其Bmax值降低了约64%,Kd值升高了约44%,表现出受体最大结合容量降低及受体与配体亲和力减小的趋势,但经统计学分析,没有显著性差异(Student’s t检验,P>0.05)。此结果提示,CHO-μ68-ABIN1-19细胞中的ABIN1蛋白可能干扰了μ阿片受体与配体的亲和力,因影响的强度不大,且实验中标准差较大,所以没有出现显著性差异。6、在[35S]-GTPγS实验中,观察到对照组CHO-μ-68的EC50值为(19.8±1.51)nmol/L ;CHO-μ68-ABIN1-18细胞株和CHO-μ-68细胞株相比,未见明显变化。CHO-μ68-ABIN1-19细胞株和CHO-μ-68细胞株相比,其EC50值表现出了下降的趋势,经统计学分析,没有显著性差异(Student’s t检验,P>0.05)。该结果与受体结合试验一致,CHO-μ68-ABIN1-19细胞中的ABIN1蛋白降低了受体的亲和力,也可能影响了μ阿片受体的激动活性。7、在单转和共转细胞上,用forskolin(10μmol/L)激动Gs蛋白,细胞内的cAMP浓度均明显升高;阿片受体激动剂DAMGO通过对μ阿片受体的激动作用激活Gi蛋白,显著抑制forskolin诱导的cAMP浓度升高。共转CHO-μ68-ABIN1-19细胞株和CHO-μ68-ABIN1-18细胞株分别与单转CHO-μ-68细胞株相比(两两比较,Student’s t检验),细胞内cAMP浓度均有降低趋势,但没有显著性差异(P>0.05)。提示,ABIN1对μ阿片受体后信号传导通路中cAMP信号分子可能有影响,但不是很明显。实验小结:通过Pull-down、免疫荧光共定位及免疫共沉淀实验验证明,蛋白ABIN1与μ阿片受体存在相互作用。通过对受体亲和力、受体激动活性和受体后信号分子的功能测定,分析蛋白ABIN1对μ阿片受体功能可能有一定的影响,确切的结论有待进一步研究证明。

蛋白ABIN1与μ阿片受体的作用及其功能影响研究

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