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APOBEC-3F和-3G与乙肝核心抗原的相互作用及其在细胞中定位研究

作　者: 曾祥兴
导　师: 李康生；王革非
学　校: 汕头大学
专　业: 医学免疫学
关键词: 载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽 乙肝核心抗原 亚细胞定位 蛋白相互作用
分类号: R512.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


研究目的和意义载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽(apolipoprotein B mRNA-editing enzymecatalytic-polypeptide，APOBEC)家族，是近年来发现的具有抗病毒作用的天然免疫分子，可通过DNA编辑、RNA编辑以及非编辑途径对HIV和HBV等多种病毒进行抑制。其中A3F和A3G可通过多种途径抑制HBV的复制，其通过与HBcAg的相互作用，抑制HBV前体RNA的包装，通过非编辑途径发挥病毒抑制功能；亦可通过编辑途径对HBV基因组超突变。但目前尚有一些机制仍不明确，A3F和A3G与HBcAg的相互作用是直接的蛋白结合还是经细胞内其它蛋白介导结合；A3F和A3G的亚细胞定位与其不同途径抑制病毒复制的功能之间的联系等。为此，本研究通过对A3F和A3G进行克隆、表达、亚细胞定位分析以及与乙肝核心抗原相互作用进行研究，以期揭示A3F和A3G抑制HBV的部分待解决的疑问。材料和方法1.提取经PHA刺激的人外周血单个核细胞的RNA，RT-PCR克隆人A3F和A3G的cDNA，并构建其酵母双杂交表达载体pGADT7-3G/-3F；PCR克隆HBV ayw亚型核心抗原HBcAg基因，构建其酵母双杂交表达载体pGBKT7-HBcAg。2.排除自激活效应后，将构建的载体pGBKT7-HBcAg分别与pGADT7-3G和pGADT7-3F共转化到AH109酵母菌，利用营养二缺平板及四缺平板培养、α-半乳糖苷酶活性测试，检测HBcAg与A3F和A3G的直接相互作用。3.构建含有HBcAg、人A3F和A3G基因的多种标签融合真核表达载体，脂质体法转染HeLa细胞进行免疫共沉淀实验和免疫共沉淀回收产物的Western blotting检测。4.人A3F和A3G的真核表达载体转染MDCK细胞，间接免疫荧光检测人A3F和A3G的亚细胞定位。5.构建含有核定位信号的绿色荧光蛋白表达载体，转染MDCK细胞，观察核定位信号的定位功能；并将人A3F和A3G与上述经功能验证具有核定位功能的核定位信号融合表达，免疫荧光观察人A3F和A3G是否发生转位。结果及结论1.酶切及DNA测序分析表明成功克隆HBcAg、人A3F和A3G，并成功构建酵母双杂交、免疫共沉淀、真核表达及亚细胞定位相关的表达质粒。2.通过酵母双杂交实验对α-半乳糖苷酶定性和定量检测显示，A3F和A3G蛋白均与HBcAg蛋白可能不存在相互作用亦或是并不发生直接的相互作用，而是可能通过某个蛋白的介导而发生间接相互作用。3.将构建好的pcFlag-3F、pcFlag -3G、pcMyc-HBcAg质粒分别进行转染HeLa细胞48hr后通过Western blot显示A3F和A3G蛋白和HBcAg蛋白在HeLa细胞中均能很好表达；进一步将转染48hr后的HeLa细胞裂解产物进行Co-IP实验显示A3F/A3G蛋白和HBcAg蛋白均能被沉淀下来，而蛋白量有所下降。4.在荧光显微镜下观察显示A3F和A3G重组蛋白呈密集点状主要分布在细胞胞浆，而胞核位置无明显荧光信号。表明A3F和A3G蛋白主要定位于细胞胞浆。5.荧光观察显示转染pEGFP-C1对照载体的MDCK细胞，其GFP弥散分布在细胞中，而与BNLS及MNLS融合表达的GFP主要分布于细胞核中。表明，BNLS和MNLS均显示核定位生物学活性。6.荧光观察显示MNLS及BNLS融合表达的A3F和A3G，仍然主要分布在细胞胞浆中。上述结果表明，可以有效引导GFP进入细胞核的MNLS及BNLS，不能将A3F和A3G有效地转运至细胞核，推测A3F和A3G中可能存在更强的胞浆定位信号或与其他胞浆蛋白具有较强的结合活性。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-8
英文缩略词表  8-12
第一章 A3F 和A3G 与HBcAg 的相互作用研究  12-53
  一 前言  12-17
  二 材料和方法  17-42
    2.1 实验材料与仪器  17-23
      2.1.1 细胞系  17
      2.1.2 酵母菌株  17
      2.1.3 质粒  17-20
      2.1.4 实验仪器设备  20-21
      2.1.5 实验试剂  21-23
      2.1.6 其他材料  23
    2.2 实验方法  23-42
      2.2.1 试剂配制  23-27
      2.2.2 传代细胞培养  27-28
      2.2.3 真核细胞表达载体的构建  28-38
      2.2.4 酵母双杂交  38-39
      2.2.5 转染细胞  39
      2.2.5 免疫共沉淀  39-40
      2.2.7 Western blot  40-42
  三 结果  42-46
    3.1 基因克隆及质粒构建的鉴定结果  42
    3.2 酵母双杂交检测A3G/A3F 分别与HBcAg 的相互作用  42-46
      3.2.1 酵母菌在二缺平板、四缺平板上的生长  42-44
      3.2.2 X-gal 试验结果  44
      3.2.3 α-半乳糖苷酶活性定量检测  44-45
      3.2.4 Western blot 结果  45-46
  四 讨论  46-48
  五 结论  48-49
  参考文献  49-53
第二章 A3F 和A3G 在MDCK 细胞中定位研究  53-67
  一 前言  53-55
  二 材料与方法  55-61
    2.1 实验材料与仪器  55-56
      2.1.1 细胞系  55
      2.1.2 质粒  55-56
      2.1.3 实验仪器设备  56
      2.1.4 实验试剂  56
    2.2 实验方法  56-61
      2.2.1 试剂配制  56
      2.2.2 传代细胞培养  56-57
      2.2.3 真核细胞表达载体的构建与亚定位检测  57-61
  三 结果  61-64
    3.1 A3F 和A3G 真核表达载体的酶切鉴定  61
    3.2 A3F 和A3G 的亚细胞定位  61-62
    3.3 含有核定位信号的绿色荧光蛋白的亚细胞定位检测  62-63
    3.4 含有核定位信号的A3F 和A3G 的亚细胞定位检测  63-64
  四 讨论  64-65
  五 结论  65-66
  参考文献  66-67
个人简历  67-68
致谢  68-69
附录1  69-70
附录2  70-71
附录3  71

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病 > 病毒传染病 > 病毒性肝炎 > 乙型肝炎
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