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水稻转录因子OsBP-73靶基因的初步筛选与水稻基因OsRRM及其同源基因OsRRMT相互作用因子的筛选

作　者: 刘淑敏
导　师: 朱瑞良
学　校: 华东师范大学
专　业: 植物学
关键词: OsBP-73 靶基因 pull-down OsRRM OsRRMT 酵母双杂交蛋白相互作用
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

本论文主要包括以下两方面内容：1．水稻转录因子OsBP-73靶基因的初步筛选在基因的转录调控网络中，转录因子(反式作用因子)与靶基因间的相互作用是构成基因表达调控网络的基础。它们的作用主要是使每一个基因在复杂的生命活动过程中适时、适地、适量地表达。鉴定出转录因子的靶基因可以帮助人们了解复杂生命活动的本质。本论文研究所在实验室以水稻蜡质基因上游-840bp——810bp之间一段能增强基因表达，并能与水稻胚乳核蛋白结合的31bp顺序为鱼饵，利用酵母单杂交系统从水稻cDNA表达文库中筛选到3个编码DNA结合蛋白的阳性克隆，OsBP-73(Oryza sativa Binding Protein)是其中的一个阳性克隆。OsBP-73基因不仅在水稻胚乳组织中表达，而且在根、茎和叶等组织中也都有表达；双链RNA干扰实验又观察到水稻转基因植株在营养生长期出现生长抑制现象。这就暗示着转录因子OsBP-73不仅调控Wx基因表达，影响水稻胚乳组织中的直链淀粉含量，还可能调控一些其它基因的表达，从而影响水稻的生长发育。本文对转录因子OsBP-73在水稻整个基因组的靶基因进行了初步筛选：首先在大肠杆菌中诱导表达获得水稻转录因子OsBP-73的蛋白p512(全长)和p73(非全长，含有DNA结合功能域)，再用纯化后的p73蛋白通过pull-down方法对其靶基因进行了初步筛选，获得22个阳性克隆，为进一步研究转录因子OsBP-73参与的水稻转录调控网络提供依据。2．水稻基因OsRRM及其同源基因OsRRMT相互作用因子的筛选本论文研究所在实验室通过启动子捕获方法分离到一个在水稻胚乳中特异表达的基因OsRRMo OsRRM具有两个RRM(RNA recognition motif)结构域、一个SPOC(Spen paralog and ortholog C-terminal)结构域和一个类似L-Zip(Leucine zipper)的结构域，是水稻中第一个被报道的Spen基因。Spen基因最早在动物中被命名，在动物中Spen基因家族的成员通常需要和其它蛋白相互作用而发挥其生理功能。因此本文运用酵母双杂交的方法，对水稻OsRRM基因及其同源基因OsRRMT的相互作用因子进行了初步筛选，分别获得了6个和5个阳性克隆，为进一步研究OsRRM和其同源基因OsRRMT在水稻中的生物学功能和分子机制提供一些线索。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
第一章综述:转录因子靶基因的鉴定  12-22
  1 通过转录因子表达水平的变化鉴别靶基因  12-14
    1.1 转录因子基因的敲除  12-13
    1.2 转录因子的超表达  13
    1.3 转录因子基因的诱导表达  13-14
  2 通过转录因子结合的特异靶序列鉴别靶基因  14-21
    2.1 ChIP  14-18
      2.1.1 ChIP-chip  14-16
      2.1.2 STAGE(Sequenec tag analysis of genomic enrichment,基因组富集的序列标签分析)  16-17
      2.1.3 ChIP-PET  17-18
    2.2 DamID  18-19
    2.3 Pull-down  19
    2.4 PBMs(protein binding microarrys,蛋白结合芯片)  19-20
    2.5 生物信息学方法  20-21
  3 结语  21-22
第二章水稻转录因子OsBP-73靶基因的初步筛选  22-36
  1 前言  22
  2 材料与方法  22-25
  3 结果  25-34
    3.1 水稻转录因子OsBP-73c512在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化  25-29
      3.1.1 大肠杆菌表达质粒pEB512  25
      3.1.2 重组质粒pEB512在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达和可溶性分析  25-28
      3.1.3 p512蛋白的纯化  28-29
    3.2 水稻转录因子OsBP-73c73在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化  29-31
      3.2.1 大肠杆菌表达质粒pEB73  29
      3.2.2 在大肠杆菌中诱导表达p73蛋白  29-31
      3.2.3 p73蛋白的纯化  31
    3.3 p73蛋白靶基因的初步筛选  31-34
  4 讨论  34-36
第三章水稻基因OsRRM及其同源基因OsRRMT相互作用因子的筛选  36-58
  1 前言  36-37
  2 材料与方法  37-40
  3 结果  40-51
    3.1 水稻OsRRM蛋白相互作用因子的筛选  40-49
      3.1.1 诱饵载体的构建  40-45
      3.1.2 pEGb、pEGc和pEGab相互作用蛋白的筛选  45-49
        3.1.2.1 pEGb相互作用蛋白的筛选  45-48
        3.1.2.2 pEGc相互作用蛋白的筛选  48-49
        3.1.2.3 pEGab相互作用蛋白的筛选  49
    3.2 水稻OsRRMT蛋白相互作用因子的筛选  49-51
      3.2.1 诱饵载体的构建  49-50
      3.2.2 OsRRMT蛋白相互作用因子的筛选  50-51
  4 讨论  51-58
第四章结论与展望  58-60
附录Ⅰ 缩略词及其英汉对照表  60-61
附录Ⅱ 硕士期间发表论文  61-62
参考文献  62-71
致谢  71

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