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El Tor型霍乱弧菌中TcpA菌毛和pⅢ~（CTX）蛋白间的相互作用

作　者: 熊理凤
导　师: 阚飙
学　校: 中国疾病预防控制中心
专　业: 病原生物学
关键词: TcpA pIIICTX 蛋白相互作用 GST-pull down SPR-BIACORE
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


霍乱的病原体是霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。根据霍乱弧菌菌体(O)抗原的不同建立的血清分型方案可将霍乱分为200多个血清群。但能致病的霍乱只有O1和O139两个血清群。其中,O1血清群可以分为古典型和El Tor型两种生物型,前者曾引发了第六次世界范围的霍乱流行,而现在仍处于的第七次世界大流行是由El Tor型霍乱弧菌引起的。霍乱的剧烈腹泻是由霍乱毒素所致。而霍乱毒素是由霍乱染色体上的前噬菌体(溶原性丝状噬菌体)CTXΦ所携带的ctxAB基因编码。在一定条件下,前噬菌体CTXΦ能被诱导成为具有感染能力的噬菌体,并在特异性attB位点整合到染色体中,从而造成ctxAB基因在产毒株与非产毒株之间的水平转移,进而引起新的流行菌株的出现。而来自不同血清群或生物型的CTXΦ之间是存在着一定的差异的。那么,研究不同来源的噬菌体CTXΦ和不同宿主霍乱弧菌的相互作用,对于了解霍乱弧菌毒力基因的水平转移、霍乱弧菌不同时期流行株的转变,以及预测新的流行菌株的出现等有着重要意义。CTXΦ感染霍乱弧菌的过程,首先是CTXΦ对宿主特异的受体的识别和相互作用。有遗传学证据间接表明,CTXΦ感染霍乱弧菌的受体为Tcp菌毛(TcpA蛋白),而噬菌体上的配体为pⅢCTX蛋白。但一直以来并没有直接的实验证据来验证在一推论的成立。本课题首先选取引起第七次世界大流行的El Tor型霍乱弧菌为主要研究对象,采用FITC荧光标记、GST融合蛋白沉降(GST-pull down)及表面等离子体共振(SPR)等技术,来研究TcpA菌毛蛋白与pⅢCTX蛋白间的相互作用,旨在找到它们之间存在相互作用的直接证据,为进一步研究溶原性CTXΦ与宿主霍乱弧菌引起疾病暴发和流行间的相互关系做准备。我们首先构建带His标签的TcpA蛋白和pⅢCTX蛋白,并通过亲和层析的方法进行纯化。通过FITC标记的方法,使来自El Tor生物型的霍乱弧菌N16961的pⅢCTX蛋白带上FITC标记,然后让标记好的pⅢCTX蛋白与经过菌毛表达条件诱导的古典型和El Tor型霍乱弧菌分别作用,在激光共聚焦显微镜下观察pⅢCTX蛋白与霍乱弧菌的体外结合情况。结果表明,来自El Tor生物型的霍乱弧菌N16961的pⅢCTX蛋白与古典型的霍乱弧菌存在体外结合,并且,我们通过构建缺失株做对照的方法证实,这种体外结合是由TcpA菌毛蛋白介导的。同时,我们还构建并纯化了带GST标签的pⅢCTX蛋白。用GST融合蛋白沉降技术(GST-pull down),我们证实：来自El Tor生物型霍乱弧菌N16961的pⅢCTX蛋白与来自El Tor型(N16961)及古典型(0395)霍乱弧菌的TcpA蛋白之间均存在体外的直接相互作用。在以上研究的基础上,我们还采用了表面等离子体共振(SPR-BIACORE)技术来定量分析这两个蛋白间的作用力。将来自El Tor型霍乱弧菌N16961的融合蛋白GST-pⅢCTX蛋白偶联到CM5芯片上,来捕获流过芯片表面的TcpA蛋白溶液,进而分析这两个蛋白相互作用的亲和力常数。本研究通过多种体外相互作用的方法,证实了在El Tor型霍乱弧菌N16961当中TcpA蛋白与pⅢCTX蛋白之间存在直接的相互作用,同时也发现：El Tor型霍乱弧菌N16961的pⅢCTX蛋白与古典型霍乱弧菌0395的TcpA蛋白间存在相互作用,而古典型的pⅢCTX与古典型的TcpA菌毛蛋白之间,以及古典型的pⅢCTX与El Tor型的TcpA菌毛蛋白之间没有观察到直接的相互作用,提示我们来自不同血清群的pⅢCTX和TcpA蛋白间的相互作用存在着差异,这种差异体现的是携带霍乱毒素基因ctxAB的噬菌体CTXΦ感染不同宿主间的差异,也就有可能是霍乱弧菌不同血清群是否致病和引起流行的重要原因和判断依据。在后续的研究当中,我们将以此为切入点,对来自不同血清群的pⅢCTX和TcpA蛋白间的相互作用及其差异进行进一步的研究,来探索不同血清群的霍乱弧菌是否引起疾病暴发和流行的真正原因。

全文目录


目录  4-5
ABBREVIATION  5-6
论文摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-13
第一部分、pⅢ~(CTX)与TcpA的克隆表达及纯化  13-31
  实验材料  13-15
  实验方法  15-23
  结果  23-31
第二部分、pⅢ~(CTX)蛋白(His.Tag)与霍乱弧菌的体外结合  31-40
  实验材料  31-32
  实验方法  32-36
  结果  36-40
第三部分、GST融合蛋白沉降验证pⅢ~(CTX)与TcpA细胞外的相互作用  40-47
  实验材料  40-41
  实验方法  41-42
  结果  42-47
第四部分、利用SPR-BIACORE进一步验证pⅢ~(CTX)与TcpA间的相互作用  47-54
  实验材料  47-48
  实验方法  48-49
  结果  49-54
讨论  54-58
小结  58-59
参考文献  59-64
综述  64-75
致谢  75-76

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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