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巴西固氮螺菌Sp7中与NifA有相互作用的因子的筛选和功能分析

作　者: 管乐
导　师: 陈三凤
学　校: 中国农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 巴西固氮螺菌 NifA蛋白蛋白相互作用酵母双杂合系统
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

在巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Sp7中，NifA蛋白是固氮基因(nifgene)的转录激活蛋白，筛选和鉴定与其有相互作用的因子是研究NifA蛋白的一个途径。首先，将A．brasilense Sp7的nifA全序列构建在pGBD-C2载体上，得到重组质粒pGBD-nifA，以其为诱饵，筛选Sp7质粒基因组文库(构建在pGAD系列质粒上)。诱饵质粒和文库质粒共转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)PJ69-4A，通过检测报告基因his3、ade2及lacZ的表达进行筛选，初筛得到109个阳性酵母菌落。分别对其中的AD/library质粒进行分离纯化，将每个纯化质粒再次与诱饵质粒共转化酵母PJ69-4A进行验证，得到11个阳性克隆，测序结果显示其中有4个不同的基因片段，分别命名为S4、S35、S64和S65。对这4个片段进行核苷酸序列和蛋白序列的同源性比对，发现它们与一些功能保守的结构域具有同源性。为了进一步验证这些克隆的编码产物与NifA蛋白的相互作用，将它们与nifA基因互换载体后共转化酵母，仍然可以激活三个报告基因的表达，而阳性克隆移码表达的重组质粒和pGBD-nifA的共转化物则不能在选择性平板上生长。用单交换的方法构建部分二倍体突变株，对阳性因子进行功能分析。通过抗性平板筛选，及接合子的PCR鉴定，得到了相应的突变株，以Sp7野生型为对照，测定了突变株在不同的铵浓度下的固氮酶活，发现它们与野生型存在一定差异，推测这些阳性因子可能参与固氮调控的信号传导，但它的具体功能及与NifA蛋白的作用方式有待进一步的研究。

全文目录

第一部分固氮基因调控研究进展  6-20
  1.1 导言  6-7
  1.2 自生固氮菌固氮基因调控  7-15
  1.3 根瘤菌固氮基因调控简述  15
  1.4 联合固氮菌固氮基因调控  15-20
第二部分酵母双杂合系统原理  20-23
  2.1 酿酒酵母gal基因及GAL4蛋白  20
  2.2 酵母双杂合系统原理  20-21
  2.3 酿酒酵母PJ69-4A双杂合系统特点  21-23
第三部分材料与方法  23-36
  3.1 实验材料与试剂  23-27
  3.2 实验方法  27-36
第四部分实验结果和分析  36-62
  4.1 巴西固氮螺菌Sp7质粒基因组文库的筛选及阳性验证  36-54
  4.2 4个阳性克隆的初步功能分析  54-60
  4.3 总结和讨论  60-62
参考文献  62-67
致谢  67-68
个人简历  68

巴西固氮螺菌Sp7中与NifA有相互作用的因子的筛选和功能分析

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