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福氏2a志贺氏菌2457T argT基因功能的研究

作　者: 曹晓玉
导　师: 何建勇；王恒樑
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 福氏2a志贺氏菌 ArgT蛋白 基因敲除 双向电泳 蛋白相互作用
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


志贺氏菌属(Shigella spp.)细菌俗称痢疾杆菌,是一类不形成芽孢的革兰氏阴性杆菌,能够通过侵袭肠上皮细胞,引起以发热、腹痛、腹泻为特征的典型痢疾症状。据WHO统计,每年约有1.647亿人感染痢疾,110万人死亡,大多数为5岁以下的儿童。福氏志贺氏菌是发展中国家主要的感染菌株,2a血清是主要的血清型。在我国,每年大约有2000万人次感染痢疾,感染或大流行的痢疾杆菌中50-70%是由福氏2a志贺氏菌引起,因此,志贺氏菌的基础研究对我国卫生防疫工作尤为重要。有研究表明,福氏2a志贺氏菌在37℃时发挥完整的细胞侵袭力,而在30℃时却不能侵袭上皮细胞。本实验室对福氏2a志贺氏菌2457T不同培养温度下全菌蛋白的比较蛋白质组研究发现:在37℃培养至稳定期时,ArgT蛋白丰度很低,而在30℃时却明显提高。ArgT蛋白又称赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸转运蛋白,定位于细胞周质间隙内,行使着将细胞外氨基酸转运到细胞内的功能。为进一步研究ArgT蛋白在志贺氏菌毒力发挥中的作用,本研究采用改进的λ-Red重组系统成功构建了argT缺失突变株,利用定点突变的方法成功构建了ArgT过表达突变株,并对所得突变株进行了一系列的研究。结果表明:ArgT对菌体的生长及代谢影响不大;对野生株和突变株进行竞争性侵袭HeLa细胞的毒力评价模型及小鼠肺部侵袭发现,argT缺失对毒力无影响,而过表达却使毒力明显下降,这些实验推测argT是福氏志贺氏菌中一个新的抗毒力基因;利用双向电泳和质谱技术对野生株和突变株进行37℃全菌蛋白的比较蛋白组学研究,检测到10个蛋白差异点,代表9种蛋白,其中ArgT过表达突变体中外膜蛋白OmpA表达下调,说明ArgT影响细菌的通透性;热休克蛋白HtrA在ArgT不同的表达体中的差异表达引起了我们的注意。利用GST-pulldown技术筛选与ArgT相互作用的蛋白,经质谱分析发现外膜蛋白调节子OmpR蛋白与之发生相互作用,并进行了WestemBlotting体外验证,结果表明两者存在相互作用。OmpR是双组分渗透压感知调节系统(OmpR/EnvZ)的一部分,是一个毒力相关因子,可以调节vir基因和OmpF/C的表达。所以本研究得出:ArgT对福氏志贺氏菌的代谢影响不大,但过表达会造成毒力的下降,并使膜的通透性改变,影响物质的转运。

全文目录


中文摘要  10-11
英文摘要  11-13
绪论  13-18
第一章 福氏2a志贺氏菌2457T argT突变体的构建及性状检测  18-37
  1 材料与方法  19-26
    1.1 菌株及生物材料  19
    1.2 试剂配制  19-20
    1.3 培养基配制  20
    1.4 PCR引物设计及扩增  20-22
    1.5 线性打靶DNA的构建  22-23
    1.6 argT缺失突变体的构建  23-24
    1.7 argT回复体2457T argTH的构建  24
    1.8 ArgT过表达突变体的构建及鉴定  24
    1.10 突变株与野生株生长状态的测定  24-25
    1.11 突变株与野生株生化实验比较  25
    1.12 野生株与突变株豚鼠角膜实验比较  25
    1.13 野生株与突变株对HeLa细胞的竞争性侵袭  25-26
    1.14 小鼠肺侵袭感染实验  26
  2 结果  26-33
    2.1 2457T △ argT::Kan缺失突变体的构建与验证  26-27
    2.2 argT回复株的构建与验证  27
    2.3 ArgT过表达突变体的构建与鉴定  27-28
    2.4 突变株与野生株生长状态的测定  28-29
    2.5 突变株与野生株在生化水平上的比较  29-31
    2.6 突变株与野生株豚鼠角膜实验比较  31-32
    2.7 福氏2a志贺氏菌2457T突变株与野生株侵袭能力的比较  32-33
  3 讨论  33-37
    3.1 缺失突变体的构建  33-34
    3.2 过表达突变体的构建  34-35
    3.3 生长状态和生化鉴定  35
    3.4 ArgT会降低痢疾杆菌的毒力  35-37
第二章 福氏2a志贺氏菌2457T突变株与野生株蛋白表达图谱的差异比较  37-49
  1 材料与方法  38-43
    1.1 生物材料  38
    1.2 主要化学试剂与耗材  38
    1.3 主要仪器与分析软件  38
    1.4 常用溶液的配制  38-39
    1.5 全菌蛋白的样品制备  39-40
    1.6 蛋白样品纯化  40
    1.7 双向电泳  40-41
    1.8 制备型电泳凝胶的考马斯亮蓝染色  41
    1.9 图像扫描与分析  41-42
    1.10 胶内酶切  42
    1.11 差异蛋白点的MALDI-TOF检测  42
    1.12 差异蛋白点的ESI-MS/MS检测  42-43
    1.13 数据库查询  43
  2 结果  43-46
    2.1 野生株与突变株双向电泳图谱  43-45
    2.2 差异表达的蛋白质及其鉴定结果  45-46
  3 讨论  46-49
    3.1 福氏2a志贺氏菌2457T argT突变株与野生株差异表达的外膜蛋白  46
    3.2 福氏2a志贺氏菌2457T argT突变株与野生株差异表达的周质蛋白  46-47
    3.3 福氏2a志贺氏菌2457T argT突变株与野生株差异表达的其它蛋白  47-49
第三章 筛选及鉴定与ArgT相互作用的蛋白  49-58
  1 材料与方法  50-54
    1.1 生物材料与化学试剂  50
    1.2 主要仪器与分析软件  50
    1.3 常用溶液的配制  50
    1.4 PCR引物设计和扩增条件  50-52
    1.5 去信号肽的ArgT蛋白的表达与纯化  52
    1.6 His-OmpR蛋白的表达与纯化  52-53
    1.7 GST-pulldown捕获全菌蛋白及质谱鉴定  53-54
    1.8 蛋白体外相互作用的验证  54
  2 结果  54-56
    2.1 重组载体的构建  54
    2.2 去信号肽的ArgT融合蛋白纯化结果  54
    2.3 GST-pull down的结果  54-55
    2.4 体外蛋白相互作用的验证  55-56
      2.4.1 His-OmpR蛋白的纯化  55-56
  3 讨论  56-58
结论  58-59
参考文献  59-63
致谢  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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