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白斑综合征病毒（WSSV）重复单元ORF94的序列差异分析及囊膜蛋白的相互作用

作　者: 孟璐
导　师: 费荣梅
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 白斑综合征病毒 ORF94 囊膜蛋白 相互作用
分类号: S945.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是引起对虾白斑综合征(White spot syndrome, WSS)的病原,其宿主十分广泛,包括人工养殖对虾及大部分野生虾蟹类等40余种,对虾在感染该病毒后2-7天死亡率可达100%,因此对全球虾养殖业危害较大。目前,NCBI上公布的WSSV全基因序列组只有三个,分别是泰国株(AF369029),中国大陆株(AF332093)和中国台湾株(AF440570),其同源性高达99.32%,但也存在一些主要的基因变异,其中之一为重复单元数量变化(variable number of tandem repeats, VNTR).为了研究ORF94中重复单元数量变化的差异,本研究对分离自江苏和浙江省的野毒株进行了ORF94基因扩增、序列比对和重复单元数量变化的分析,并选取重复单元数量区别较大的两株分离株人工接种克氏原螯虾(Procambarus clarkii)记录死亡率,并探索VNTR与毒力的相关性。此外,病毒的囊膜对病毒的活动起到重要的作用,但目前关于该病毒囊膜蛋白间互作的研究鲜有报道,主要原因可能是缺乏有效细胞系。VP28是WSSV四个主要囊膜蛋白之一,其主要在病毒吸附和侵入过程中起作用。为了研究VP31和VP36A是否能与VP28之间发生相互作用,本研究对VP28、VP31和VP36A进行了克隆表达,纯化病毒并分离WSSV囊膜蛋白,利用Far-Western和Pull-Down assay的方法检测VP28与VP31和VP36A的互作。根据GenBank上白斑综合征病毒(WSSV)泰国株ORF94的基因组序列设计一对引物,将从江苏和浙江采集已发病白斑综合症地区的对虾提取病毒DNA,对目的片段基因进行扩增,并插入pMD-18T载体中构建克隆载体pMD-N,测序后与GenBank中收录的其他WSSV毒株进行同源性比对,发现这些序列与GenBank中收录的WSSV毒株同源性高于95%,同时,重复单元ORF94的序列差异分析显示重复单元数量介于2至14之间,第48位碱基差异较大。选取重复单元数量区别较大的两株分离株,分别分离自江苏赣榆和大丰,人工接种克氏原螯虾记录死亡率计算半数致死量,赣榆株为10-5.6,大丰株为10-5.5。然后根据其半数致死量采取肌肉注射的方法对克氏原螯虾进行攻毒。每隔12小时观察并记录一次克氏原鳌虾的存亡情况,将死亡及未死亡的部分虾于-40。C冻存,按上述方法进行重复单元ORF94的序列差异分析,发现攻毒后再分离的毒株间重复单元数量无差异,而第48位碱基差异较小,所以ORF94的序列差异可能与病毒毒株强弱的相关性不大。剩余的死虾浸泡在Davidson’s AFA固定液中,再用戊二醛固定,按常规方法做超薄切片,观察细胞及病毒形态。根据参考文献中的方法,利用Nonidet P-40、Triton X-114和丙酮等处理纯化过的菌体,分离出WSSV的蛋白。再以白斑综合征病毒(WSSV)赣榆株为模板,设计三对引物,分别扩增得到了VP28.VP31和VP36A的片段,将其分别T-A克隆到pMD-18T载体后,再分别亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-4T-3中,然后将重组质粒转入宿主菌BL21中,在37℃下用1mM浓度的IPTG诱导三个片段均获得良好的表达。经SDS-PAGE鉴定,其表达的融合蛋白约为28kDa、7kDa和62kDa,与预期值一致。利用Far-Western实验和Pull-Down assay实验检测VP28是否能与VP31或VP36A发生相互作用,结果是未发现它们之间有相互作用。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11缩略语  11-12第一篇 文献综述  12-42  第一章 白斑综合征病毒的研究进展  12-28    1 病原学  12-14    2 流行病学  14    3 易感动物与传播机制  14-16    4 临床症状和病理变化  16-17    5 对虾白斑综合征病毒的诊断  17-18      5.1 临床症状的观察  17      5.2 组织病理学和电子显微镜的观察  17-18      5.3 免疫学方法  18      5.4 分子生物学方法  18    6 小结  18-20    参考文献  20-28  第二章 白斑综合征病毒的分子生物学研究进展  28-42    1 对虾白斑综合征病毒的基因组学研究  28-33      1.1 对虾白斑综合征病毒的基因组特征  28-29      1.2 对虾白斑综合征病毒的基因组可变区位点研究进展  29-33    2 对虾白斑综合征病毒的蛋白组学研究  33-36      2.1 对虾白斑综合征病毒结构蛋白研究  33-35      2.2 对虾白斑综合征病毒结构蛋白相互作用的研究  35-36    3 小结  36-37    参考文献  37-42第二篇 试验研究  42-78  第一章 白斑综合征病毒(WSSV)分离株重复单元ORF94的序列差异分析及毒力比较  42-58    1 材料  42-44      1.1 毒株  42-43      1.2 试验动物  43      1.3 主要试剂、质粒与菌株  43      1.4 主要仪器设备  43      1.5 PCR引物设计  43-44    2 方法  44-47      2.1 病料组织中总病毒的提取  44      2.2 PCR  44-45      2.3 产物克隆及测序  45      2.4 ORF94基因序列重复单元数量分析  45      2.5 WSSV人工接种克氏原螯虾  45-46      2.6 人工接种WSSV死亡的克氏原螯虾ORF94重复单元数量差异比对  46-47      2.7 人工接种WSSV死亡的克氏原螯虾电镜观察  47    3 结果  47-53      3.1 各毒株检测结果  47      3.2 不同分离株株ORF94片段长度  47-48      3.3 不同毒株ORF94中单向重复单元数量  48-49      3.4 半数致死量(LD50)测定结果  49-51      3.5 人工接种不同毒株测定其毒力  51      3.6 人工接种WSSV死亡的克氏原螯虾ORF94重复单元数量差异比对  51-53      3.7 电镜观察  53    4 讨论  53-55    参考文献  55-58  第二章 白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28与VP31、VP36A之间的相互作用  58-78    1 材料  59-60      1.1 毒株  59      1.2 主要试剂、质粒与菌株  59      1.3 PCR引物设计  59-60      1.4 主要仪器设备  60    2 方法  60-67      2.1 病料组织中总病毒组的提取  60      2.2 PCR  60-61      2.3 重组克隆质粒pMD-VP28、pMD-VP31和pMD-VP36A的构建  61      2.4 原核表达质粒pET-VP28、pGEX-VP31和pGEX-VP36A的构建  61-64      2.5 重组质粒在大肠杆菌BL21中的诱导表达  64      2.6 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达  64-65      2.7 重组蛋白的纯化与复性  65      2.8 Far-Western  65-66      2.9 Pull-Down assay  66-67    3 结果  67-72      3.1 VP28、VP31和VP36A的PCR扩增  67      3.2 重组质粒pET-VP28、pGEX-VP31和pGEX-VP36A的PCR鉴定和双酶切鉴定结果  67-68      3.3 重组质粒的诱导表达及包涵体的复性  68-69      3.4 Far-Western  69      3.5 Pull-Down assay  69-72    4 讨论  72-74    参考文献  74-78全文总结  78-80附录  80-84致谢  84

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治 > 虾类
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