学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

大鼠海马L-型钙通道相互作用蛋白在短暂性前脑缺血后的改变

作　者: 赵苗
导　师: 高天明
学　校: 南方医科大学
专　业: 神经生物学
关键词: L-型钙通道 GST融合蛋白 蛋白—蛋白相互作用 缺血 神经元
分类号: R743
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 104次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


脑中风是当今第三大死亡原因及首位致残原因，脑中风后的继发性神经元死亡是由于脑组织缺血缺氧所致，而目前对缺血性脑损伤的机制仍未阐明，临床也无理想的治疗手段。L-型电压敏感性钙通道在海马锥体神经元的树突和胞体都特别集中，通过L-型钙通道的电流占细胞总体钙电流的30-50％。研究发现在培养的海马神经元上，给予L-型钙通道特异性阻断剂可直接诱导神经元死亡，而给予激动剂Bay K 8644则可以对神经元起到保护作用。此外，L-型钙通道能将钙调信号直接传至细胞核，激活核内的信号转导途径，调节某些基因的表达，如c-Fos，脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和Bcl-2等，而这些基因对神经元的功能和存活都具有重要意义。上述结果都说明，L-型钙通道功能改变可能在脑缺血后海马神经元死亡过程中发挥了重要的作用，然而其参与缺血性神经细胞死亡的机制目前仍不清楚。L-型钙通道介导钙离子内流，引起胞内钙信号的变化从而调节细胞功能和活动，但其作为电信号和化学信号的整合蛋白，直接的蛋白-蛋白相互作用也可能对通道活性及细胞功能产生影响，而目前对此研究不多，尤其是在细胞信号转导过程中其下游分子及信号转导通路尚不清楚。目前已经报道有许多蛋白激酶和磷酸酶可以直接作用于L-型钙通道，如蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、蛋白磷酸酶1（protein phosphatase 1，PP1）、酪氨酸激酶Src等。钙调蛋白（calmodulin，CaM）与Ca2+结合蛋白CABP1（calcium binding protein 1）也可以竞争性的与L-型钙通道α1C亚基C末端相结合。此外，PDZ[postsynaptic density-95（PSD-95）／Discs large／zona occludens-1（ZO-1）]蛋白shank、NIL-16（neuronal interleukin-16）以及其它一些蛋白，如突触蛋白RIM（rab interacting molecular）、可溶性耐药相关钙结合蛋白sorcin、endophilin等也被发现可以与L-型钙通道直接相互作用，影响突触传递及调节通道间联系等。但目前尚未有关于L-型钙通道相互作用蛋白参与神经细胞死亡过程的报道。因此，本实验利用L-型钙通道α1C亚基的C末端为诱饵，通过GST-pull down的方法研究与L-型钙通道相互作用蛋白在大鼠前脑缺血前后的变化，试图寻找缺血性神经细胞死亡中L-型钙通道可能的下游信号分子及转导通路。首先，我们根据GenBank登录的α1C基因的编码核苷酸序列，设计合成针对其C末端（1808-2139）编码序列的一对特异性引物，从pcDNA3／α1C质粒上PCR扩增出其C末端基因，插入谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione S-transferase，GST）融合表达载体pGEX-KG中，构建了含L-型钙通道α1C亚基C末端编码序列的pGEX-KG／α1C融合蛋白表达载体，经BamHI和HindⅢ双酶切后可见约1，000 bp、5，000 bp大小的两个片段，与预期结果一致，测序结果表明序列正确。然后，在原核细胞E.coli BL21中诱导GST融合蛋白的表达，在异丙基-β-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）的诱导下，重组菌表达出一个分子量约为70 KD的表达产物，Western-blot结果证实，重组GST融合蛋白可与抗GST抗体及针对α1C亚基C末端的抗体发生特异性的反应，表明表达的蛋白为预期的融合蛋白。利用谷胱苷肽琼脂糖珠纯化GST-α1C重组蛋白，并进行SDS-PAGE分析，重组质粒分别在70 KD、40 KD、30 KD左右出现三条蛋白条带，用抗α1C一抗，羊抗兔为二抗，进行Western blot验证，三条带均呈阳性，可能GST-α1C融合蛋白在纯化过程中发生了降解。最后，采用改良的Pulsinelli四血管闭塞法制做大鼠全脑缺血模型，在缺血再灌流24小时后，提取海马组织蛋白分别与纯化后固定于谷胱苷肽琼脂糖珠的GST-α1C、GST蛋白共同孵育，洗脱后经SDS-PAGE分析，发现缺血组与假手术组相比可见三条差异条带。其中两条在缺血后与L-型钙通道结合减少，一条与L-型钙通道结合增加，说明在大鼠海马组织中存在与α1C亚基C末端片断相互作用的蛋白，且部分与L-型钙通道结合的蛋白在缺血过程中发生了变化，因此，这些发生变化的蛋白与L-型钙通道的相互作用很可能在缺血性神经细胞死亡过程中发挥了重要的作用。综上所述，我们成功构建了质粒pGEX-KG／α1C，纯化得到GST-α1C融合蛋白，并利用GST-pull down的方法观察到大鼠前脑缺血后L-型钙通道相互作用蛋白的变化，提示这些差异蛋白与L-型钙通道的结合很可能参与了缺血／缺氧性脑损伤，为下一步鉴定及研究L-型钙通道参与缺血性神经细胞死亡的机制奠定基础。

全文目录


摘要  3-6
ABSTRACT  6-10
前言  10-15
材料与方法  15-23
结果  23-29
讨论  29-32
小结  32-33
参考文献  33-41
综述  41-53
论文发表情况  53-54
致谢  54-56

相似论文

  1. 船用舵机电液伺服单元单神经元PID控制,U666.152
  2. 二维人体心室心肌缺血模型中的折返波仿真研究,R318.0
  3. 基于仿生模式识别的文本分类技术研究,TP391.1
  4. ML模型下耦合可兴奋系统的动力学研究,Q42
  5. 骨髓间充质干细胞预移植1周对大鼠心肌缺血再灌损伤的修复作用,R542.22
  6. 腺苷介导的侧脑室吗啡预处理对缺血后心肌保护作用,R542.22
  7. 肝脏部分缺血/再灌注损伤对小鼠术后认知功能的影响,R614
  8. 联合检测血清TPS，CEA，CYFRA21-1，NSE在肺癌诊断中的临床价值,R734.2
  9. 猪FTO的组织特异性表达及其调控,S828
  10. 磁疗用永磁磁源的定量分析与生物效应的研究,R454
  11. HIF-1α在犬体外循环缺血再灌注心肌胰岛素抵抗中的表达及意义,R654.1
  12. 万胜化风丹的急性肝肾毒性及对脑缺血再灌注损伤的保护作用,R285.5
  13. 慢病毒介导hVEGF-165基因转染骨髓间充质干细胞治疗大鼠后肢缺血实验研究,R329
  14. 蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞L-型钙通道及细胞内游离钙离子浓度的影响,R774.1
  15. Nrf2-ARE通路在离体鼠心缺血/吡那地尔后处理中作用的研究,R96
  16. 概念隐喻的认识论意义,B842.1
  17. 黄芪注射液对小儿机械性肠梗阻缺血—再灌注损伤的保护作用,R272
  18. 氯通道阻断剂对一氧化氮诱导培养大鼠海马神经元凋亡的影响,R363
  19. 乙醛脱氢酶2在法舒地尔心肌保护中的作用探讨,R54
  20. 缺血—再灌注损伤小鼠肾脏中解偶联蛋白2的表达及其意义,R587.1
  21. 自体冷血心脏停搏液对婴幼儿体外循环心肌MMP-2影响,R726.5

中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑血管疾病
© 2012 www.xueweilunwen.com