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HIV-1病毒样颗粒疫苗的构建及其免疫原性研究

作　者: 张喜珍
导　师: 孔维
学　校: 吉林大学
专　业: 生化与分子生物
关键词: HIV-1 共转染稳定表达病毒样颗粒疫苗中和抗体 CTL
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 202次
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内容摘要

一个成功的HIV-1 疫苗应该既能产生有效的中和抗体又能产生持久的细胞免疫,同时又要具有良好的安全性。传统的HIV-1 疫苗总是存在着这样或那样的欠缺,而VLP 疫苗以其安全性高、抗原性强等优点为HIV-1 疫苗的研究提供了一个新的思路。本论文利用哺乳动物细胞系统构建HIV-1 病毒样颗粒(VLP)疫苗。该疫苗表达HIV-1 的主要结构蛋白gagpol 和env,并研究其免疫原性,为其成为新一代艾滋病的治疗性疫苗提供重要依据。主要采用共转染及G418 抗性筛选的方法筛选单克隆细胞株,通过Western-blot 检测蛋白表达情况;经蔗糖垫密度梯度离心检测上清中的VLP 的分泌情况;SDS-PAGE 电泳及LOWRY 法初步确定分泌浓度;透射电镜观察VLP 的形态;免疫印迹及ELISA、CTL 及ELISPOT、细胞增殖等实验检测其动物体液及细胞免疫情况。结果成功筛选出了高效、稳定表达HIV-1 结构蛋白gagpol 和env 的哺乳动物细胞株,该细胞株表达的结构蛋白可自我组装成病毒样颗粒(VLP)并分泌至培养上清中,透射电镜观察可见典型病毒样颗粒,该VLP(不加任何佐剂)在动物实验中表现了很好的免疫原性。在实验进程中分三级冻存了细胞种子库,初步确定了疫苗的质量控制标准,为今后的大规模疫苗生产打下了坚实的基础。上述结果表明HIV-1 结构蛋白gagpol 和env 能够在哺乳动物细胞中高效、稳定表达,并能自我组装成VLP 分泌至上清中,动物实验证明了该HIV-1VLP 具有良好的免疫原性,可望成为新一代HIV-1 疫苗。

全文目录

第一章前言  7-24
  1.1 艾滋病相关背景  7-14
    1.1.1 艾滋病的起源及全球现状  7-8
    1.1.2 HIV-1 的流行分布  8-9
    1.1.3 HIV-1 基因组结构及其编码蛋白  9-12
    1.1.4 HIV-1 生活周期与病毒颗粒的组装  12-14
  1.2 艾滋病的治疗及其疫苗的研制  14-15
  1.3 关于HIV-1 的VLP 疫苗  15-20
    1.3.1 HIV-1 VLP 的形成机制及其两种主要形式  15-17
    1.3.2 HIV-19ag、pol 与env 蛋白的免疫学特性  17-18
    1.3.3 中和抗体和CTL 反应在控制HIV-1 感染中的作用  18
    1.3.4 HIV-1 VLP 引起免疫反应的机制  18-19
    1.3.5 HIV-1 VLP 疫苗及其研究进展情况  19-20
  1.4 本课题的立题依据  20-21
  1.5 实验思路与方案  21-24
    1.5.1 质粒与抗性筛选标记的选择  22-23
    1.5.2 稳定细胞系的构建与筛选  23
    1.5.3 HIV-1 VLP免疫原性的研究  23-24
第二章实验材料与方法  24-38
  2.1 材料、仪器和试剂  24-28
  2.2 实验方法  28-38
第三章结果与讨论  38-55
  3.1 稳定表达细胞系的获得  38-40
    3.1.1 D-GPEi 质粒在不同细胞系中的表达情况比较  38
    3.1.2 稳定表达细胞系的构建及筛选  38-40
  3.2 病毒样颗粒的提纯与检测  40-46
    3.2.1 VLP 在不同浓度蔗糖中的分布情况研究  40-41
    3.2.2 上清中VLP 的分离提纯  41-43
    3.2.3 VLP 分泌高峰的研究  43-44
    3.2.4 VLP 分泌浓度的初步测定  44-45
    3.2.5 电镜下HIV-1 VLP 的形态  45-46
  3.3 细胞表达稳定性的研究  46-48
  3.4 动物免疫原性的研究  48-55
    3.4.1 体液免疫效果分析  48-51
      3.4.1.1 血清抗体的免疫印迹检测  48-49
      3.4.1.2 ELISA 检测血清抗体滴度  49-51
    3.4.2 细胞免疫效果分析  51-55
      3.4.2.1 CTL 反应检测细胞免疫水平  51-52
      3.4.2.2 ELISPOT 实验检测细胞免疫  52-54
      3.4.2.3 细胞增殖检测细胞免疫  54-55
  3.5 细胞种子库的建立  55
结论  55-57
参考文献  57-63
中文摘要  63-65
Abstract  65-68
致谢  68-69
导师简介  69-70
作者简介  70

HIV-1病毒样颗粒疫苗的构建及其免疫原性研究

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