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HMGB1在缺氧/复氧神经元上的表达及其意义

作　者: 周艳丽
导　师: 滕军放
学　校: 郑州大学
专　业: 神经病学
关键词: 神经元缺氧/复氧 HMGB1 NF-κB rHMGB1 凋亡
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景和目的脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury CIRI）是脑梗死最常见的病理过程。CIRI致神经元损害的机制复杂多样,而缺血缺氧致神经元坏死或凋亡是CIRI的基本病理改变。大量的研究证明诸多细胞因子参与CIRI发病过程。核因子κB（nucleus factorkappa B NF-κB）已被发现与脑缺血损伤后神经细胞的凋亡和坏死有关。其作用与细胞因子的转录、启动凋亡、调控细胞周期等有关。高迁移率族蛋白Bl（highmobility group protein box 1 HMGB1）是一类富含正负电荷的非组蛋白染色质蛋白,参与许多病理生理过程,近年来发现其作为晚期炎性因子在内毒素血症的病理过程中起重要作用。近期有研究发现HMGB1与缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury IRI）密切相关,HMGB1先由损伤和坏死的细胞释放至胞外环境,激活中性粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞、神经胶质细胞等产生炎症反应,大量的炎症介质如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-αTNF-α）、白细胞介素-1（interleukin-1 IL-1）、白细胞介素-6（interleukin-6 IL-6）、细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1 ICAM-1）等释放进一步导致组织细胞的坏死和凋亡。但脑缺血再灌注后HMGB1的表达和作用国内未见研究报道,来自神经元的HMGB1对神经元有何影响更是罕见研究。本实验拟通过体外培养神经元,以缺氧/复氧(（hypoxia/reoxygenation H/R）模拟CIRI,及采用重组HMGB1（recombination HMGB1 rHMGB1）直接作用于神经元（不进行H/R）,观察神经元凋亡与HMGB1、NF-κB表达的变化,探讨及三者之间的关系,以期进一步阐明HMGB1在神经元IRI中的作用及其机制。为CIRI的防治提供新的理论依据。材料与方法1.实验分组将体外培养7 d的大鼠皮质神经元分为4组:A组为正常对照组、B组单纯采用H/R、C组单纯采用重组HMGB1（recombination HMGB1 rHMGB1）刺激（不进行H/R）验证HMGB1对神经元凋亡的影响、D组采用NF-κB抑制剂毗咯烷二硫代氨基甲酸盐（pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC）预处理+H/R。2.造模方法A组将无血清培养基换为有糖earle’s液仍在95%O₂+5%CO₂、37℃培养箱中培养;B组进行H/R处理:将培养液换为无糖earle’s液后,置37℃恒温的缺氧袋中,排尽空气,缓慢充入95%N₂+5%CO₂（流速1L/min）30min,再完全密封缺氧袋,置培养箱中培养;C组:不予H/R,单纯采用浓度为0.2ug/L rHMGB1处理;D组:H/R前先给予终浓度为1μM的PTDC预处理1h后,再给予H/R。50分钟后以上4组重新换回无血清培养基,继续在95%O₂+5%CO₂、37℃条件下培养24h。3.观察指标各组在复氧或rHMGB1刺激结束后0h、1h、3h、6h、12h、24h各时间点,倒置显微镜下观察各组细胞形态,MTT检测细胞活性,TUNEL法原位标记DNA片段检测细胞凋亡,细胞免疫组化方法检测HMGB1、NF-κB表达。结果1.倒置显微镜下观察各组细胞形态A组正常7d神经元生长良好,折光性强,胞核较大,清晰可见,突起交织成网;与A组相比,B组H/R后神经元形态差,细胞胞体变圆、缩小变形、部分破裂,突起缩短或断裂,凋亡细胞为缩小变形者。随复氧时间延长,损伤和凋亡细胞增多,C组和B组相似,rHMGB1刺激后细胞损伤亦较重,凋亡细胞较多,D组PTDC预处理后再进行H/R则细胞损伤较轻,凋亡细胞减少。2.MTT检测细胞活性与A组相比,B组H/R、C组rHMGB1刺激后细胞存活率明显下降（0～24h,P＜0.05）,随时间延长,存活率进一步降低;B组与C组相比无明显差异。PTDC预处理后的D组H/R后细胞存活率上升,与B组、C组相比差异显著（P＜0.05）,较A组细胞存活率6～24h仍低（P＜0.05）。3.TUNEL法原位标记DNA片段检测细胞凋亡与A组相比B组H/R、C组rHMGB1刺激后3h细胞凋亡开始显著增多（P＜0.05）,随时间延长,细胞凋亡进一步增加;B组与C组相比无明显差异。PTDC预处理的D组H/R后细胞凋亡减少,与B组、C组相比在3h后差异显著（P＜0.05）;与A组相比仍较多,3h后差异显著（P＜0.05）。4.HMGB1细胞免疫组化染色A组正常神经元胞核胞浆中均有HMGB1表达,但表达较低。B组HMGB1在神经元胞核中表达减少,0～3h胞浆中表达增加,12h达高峰,持续至24h,与A组相比,各时间点均具有显著性差异（P＜0.05）;C组HMGB1胞浆表达从1～3h开始增加,12h达高峰,持续至24h,与A组相比3～24h均具有显著性差异（P＜0.05）,C组与B组相比3～24h无明显差异。D组HMGB1胞浆表达明显下降,与B组相比各时间点均具有显著性差异（P＜0.05）,与C组相比3～24h各时间点均具有显著性差异（P＜0.05）;但其表达仍比A组高,然差异无统计学意义。5.NF-κB细胞免疫组化染色A组正常神经元胞核胞浆中NF-κB表达极低,以胞浆为主;B、C组NF-κB在神经元胞核表达明显增加,且随时间延长其表达逐渐增加,与A组相比3～24h差异显著（P＜0.05）;C组与B组相比无明显差异;D组NF-κB胞核表达较B、C二组明显下降,3～24h差异显著（P＜0.05）,与A组相比较高,但差异无统计学意义。6.H/R后神经元表达的HMGB1、NF-κB和神经元凋亡之间的相关性分析B组（H/R组）随复氧时间地延长,神经元胞浆HMGB1表达与TUNEL阳性细胞数的相关性分析显示:Pearson相关系数r=0.66,P＜0.05,二者呈正相关;B组随复氧时间地延长,神经元胞核NF-κB细胞表达与TUNEL阳性细胞数的相关性分析显示:r=0.774,P＜0.05,二者呈正相关;B组神经元胞浆HMGB1表达与神经元胞核NF-κB细胞表达,随复氧时间地延长相关性分析显示:r=0.737,P＜0.05,二者亦呈正相关。结论1.缺血/再灌注可使神经元HMGB1胞浆移位,表达增加,NF-κB胞核移位,表达增加;2.HMGB1可直接作用于神经元,诱导神经元的损伤、凋亡;3.HMGB1诱导缺血/再灌注神经元的损伤、凋亡的机制之一可能与NF-κB有关;4.HMGB1和NF-κB可能相互诱生。

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中文摘要  3-7
Abstract  7-13
论文部分 HMGB1在缺氧/复氧神经元上的表达及其意义  13-39
  引言  13-14
  材料与方法  14-21
  结果  21-26
  讨论  26-30
  结论  30-31
  附图  31-34
  参考文献  34-39
综述部分 HMGB1:新的细胞因子与非感染性疾病  39-63
  参考文献  53-63
后记  63-64
  缩略词  63-64
  致谢  64

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