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建立稳定过表达HMGB1蛋白的K562细胞株

作　者: 闫凡芝
导　师: 闫金松
学　校: 大连医科大学
专　业: 内科学
关键词: 过表达 HMGB1 K562 细胞白血病
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:建立过表达高迁移率族蛋白HMGB1(High mobility group protein B 1,HMGB1)蛋白的K562 细胞株(K562-HMGB1)及对照细胞株(K562-pcDNA3.1),为研究hmgb1基因在白血病发生及进展中的作用与机制打下基础。方法:从U937白血病细胞提取总RNA,逆转录合成cDNA。以cDNA为模板应用PCR技术扩增hmgb1编码基因。将其连接入PMD18-T Vector(PMD18-T-HMGB1 Vector)载体,并转化至大肠杆菌DH5a中。用含浓度为100μg/ml的氨苄青霉素筛选出的阳性克隆进行扩增、质粒抽提,应用限制性内切酶KpnI/XhoI酶切鉴定,DNA测序得到正确的克隆。然后应用限制性内切酶KpnI/XhoI切出,hmgb1基因连接入真核表达载体pcDNA3.1(+),得到重组质粒pcDNA3.1-HMGB1。将量10μg的pcDNA3.1-HMGB1、pcDNA3.1(+)质粒分别电转染至K562细胞,48小时后加入终浓度800μg/ml的G418进行加压筛选,2月后得到有效转染pcDNA3.1-HMGB1及pcDNA3.1(+)质粒的K562细胞株(K562-HMGB1,K562-pcDNA3.1)。通过RT-PCR和Western Blot分别在转录及蛋白表达水平检测K562稳定细胞株中HMGB1表达情况。验证建立的K562稳定株的功能。结果:成功构建pcDNA3.1-HMGB1表达载体,并转染至K562细胞中,建立了过表达HMGB1的K562稳定细胞株(K562-HMGB1)。在转录及蛋白表达水平上验证该稳定株过表达HMGB1。结论:已成功建立了过表达HMGB1蛋白的K562稳定细胞株及对照细胞株(K562-HMGB1细胞及K562-pcDNA3.1细胞),为研究hmgb1基因在白血病中的发生机制打下基础。

全文目录

一、摘要 6-9 （一）中文摘要 6-7 （二）英文摘要 7-9二、正文 9-28 （一）前言 9-10 （二）材料与方法 10-18 （三）结果 18-22 （四）讨论 22-25 （五）结论 25-26 （六）参考文献 26-28三、文献综述 28-38 （一）正文 28-35 （二）参考文献 35-38四、附录 38-39五、致谢 39

建立稳定过表达HMGB1蛋白的K562细胞株

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