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害虫捕食性天敌拟环纹豹蛛烟碱型乙酰胆碱受体毒理学特性研究

作　者: 松峰
导　师: 刘泽文
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 拟环纹豹蛛烟碱型乙酰胆碱受体新烟碱类杀虫剂亚基克隆选择性亚基组成
分类号: S476.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

蜘蛛作为农田害虫最重要的捕食性天敌,是农田生态系统中节肢动物群落的优势类群,其群落结构与功能的特性直接制约着害虫的发生与危害,影响着农业生产。有研究发现,吡虫啉等新烟碱类杀虫剂对蜘蛛类天敌安全,对蜘蛛的毒性明显小于甲胺磷和扑虱灵。虽然蜘蛛在农田生态系统中占有很重要的生态位,但是,对于其新烟碱类杀虫剂的靶标——烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs)的研究至今仍是空白。形成鲜明对比的是,对昆虫烟碱型乙酰胆碱受体的研究近年来取得了很好的进展,这与新烟碱类杀虫剂的广泛使用相关。新烟碱类杀虫剂不仅毒力高,同时具备很高的选择性、安全性,对哺乳动物、天敌蜘蛛比较安全。这些应用上的价值和毒理学特性上的差异,都促使人们思索并研究新烟碱类杀虫剂的选择性机理,加以应用于开发更好的选择性杀虫剂。本文以稻田蜘蛛的优势种、重要的捕食性天敌拟环纹豹蛛为材料,克隆了拟环纹豹蛛多个(?)nAChRs亚基,通过与昆虫nAChRs相同亚基相比,探索了新烟碱类杀虫剂在昆虫与蜘蛛间的毒理学差异,阐述基于β亚基的选择性机理；对亚基组合进行了探索,分析受体的亚基组成与昆虫：nAChRs亚基组成的差异,进一步探索新烟碱类杀虫剂选择作用的分子机制,同时为新型高效高选择性的杀虫剂的创制提供理论基础。一、拟环纹豹蛛烟碱型乙酰胆碱受体基因的克隆采用简并引物PCR和RACE技术首次克隆了害虫主要捕食性天敌拟环纹豹蛛7个烟碱型乙酰胆碱受体基因,这也是首次关于蛛形纲nAChRs的报道。其中包括6个全长基因和一个5’-端不全的长片段。通过与昆虫nAChRs亚基序列比对和分析,发现这些基因与昆虫的(?)nAChRs亚基具有很高的同源性,其中5个亚基具有烟碱型乙酰胆碱α亚基的典型特征,2个具有β亚基的典型结构,此外,7个亚基基因结构特征分析也显示,它们均具有烟碱型乙酰胆碱受体亚基的典型特征,如保守的半胱氨酸(α亚基还具有典型的双半胱氨酸结构)、与配基结合密切相关的保守氨基酸残基形成的环[loopA-C(α亚基),loopD-F(β亚基)]、4个跨膜片段、信号肽以及糖基化位点等。因此,根据系统进化关系,分别将这7个基因命名为Ppα1、Ppα2、Ppα3、Ppα6、Ppα7(5’-端不全)、Ppβ1和Ppβ2。二、拟环纹豹蛛Ppβ1亚基上的点突变对新烟碱类杀虫剂的选择性通过对拟环纹豹蛛nAChRsβ1亚基Ppβ1与昆虫nAChRsβ1亚基氨基酸序列的比对,发现Ppβ1与昆虫的β1亚基具有很高的同源性,但是与配基结合密切相关的D,E和F环上有几个重要的氨基酸存在着差异。本文通过Yao等(2008年)把桃蚜的β1亚基Mpβ1的三个环D、E和F构建到鼠的β2亚基上,形成嵌合体β2Mpβ1的方法,把Ppβ1亚基的D、E、F环替代桃蚜β1亚基相应的部分,与哺乳动物β亚基重组与昆虫的α亚基构建嵌合体在非洲爪蟾卵母细胞中共表达,研究了拟环纹豹蛛β1亚基D、E、F环以及环上一些关键氨基酸变化的影响。结果显示,与桃蚜嵌合体β2mpβ1相比,把β2Mpβ1的D、E、F三个环单独或一起由Ppβl亚基相应的环替代后,吡虫啉的剂量曲线均发生了显著的右移,而对ACh却几乎没有影响。进一步的研究显示,与配基结合密切相关的D、E、F环上的单个氨基酸的改变R81Q、N137G和F190W可能是敏感性发生变化的主要因素。这是首次在蛛形纲体内找到与新烟碱类杀虫剂选择性相关的氨基酸位点。三、拟环纹豹蛛烟碱型乙酰胆碱受体的亚基组成脊椎动物nAChRs受体可以以双型"pair"、三型‘’triplet"、四型"quadruplet"方式组合,也可以由同一个亚基组成同型五聚体(Papke et al.,1989; Kuryatov et al., 2000; Mishina et al.,1986; Couturier et al.,1990)。而在昆虫nAChRs亚基功能研究中,关于昆虫神经系统中nAChRs的亚基组成,即nAChRs五聚体功能单位到底是哪些亚基构成的问题始终没有解决,对昆虫nAChRs亚基进行各种组合都没能表达出受体功能,即使将来自于同一种昆虫的所有亚基共同表达仍然不成功(Millar,2003)。本文对已克隆的拟环纹豹蛛的2个α亚基(Ppα1, Ppα2)及2个β亚基(Ppβ1, Ppβ2)进行了体外表达,结果表明,在非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞异源表达系统中,Ppα1, Ppα2与脊椎动物的β2亚基共表达,能够组成一个三亚基五聚体受体Ppα1/Ppα2/rβ2。免疫共沉淀的研究结果表明,在拟环纹豹蛛体内Ppαl, Ppα2, Ppβ1及Ppβ2四个亚基能够共同组成一个受体Ppα1/Ppα2/Ppβ1/Ppβ2,并且构成了其内源nAChRs的唯一一个苯巴比妥结合位点。这是首次在无脊椎动物中发现四种亚基(2个α亚基和2个β亚基)共聚于一个受体中。

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摘要 6-8ABSTRACT 8-11第一章文献综述 11-30 1. 乙酰胆碱受体 11-12 2. 烟碱型乙酰胆碱受体 12-22 2.1 烟碱型乙酰胆碱受体的功能区域 14-18 2.2 脊椎动物的烟碱型乙酰胆碱受体 18-19 2.3 无脊椎动物的烟碱型乙酰胆碱受体 19-22 3. 作用于昆虫烟碱型乙酰胆碱受体的杀虫剂及其作用机理 22-24 4. 新烟碱类杀虫剂的选择作用 24-28 4.1. 重要的氨基酸位点及区域 25-27 4.2 不同亚基的共聚 27-28 5. 研究的目的与意义 28-30第二章拟环纹豹蛛烟碱型乙酰胆碱受体基因的克隆 30-53 1. 材料与方法 31-35 1.1 供试生物 31 1.2 主要试剂 31 1.3 总RNA提取及cDNA模板合成 31-32 1.4 PCR引物设计 32-33 1.5 拟环纹豹蛛nAChRs基因的克隆 33-35 2. 结果与分析 35-51 2.1 拟环纹豹蛛nAChRs亚基的克隆和测序 35-49 2.2 拟环纹豹蛛nAChRs亚基全长序列分析 49 2.3 拟环纹豹蛛nAChRs 6个亚基的同源性分析 49-51 3. 讨论 51-53第三章拟环纹豹蛛Ppβ1亚基上关键的特异氨基酸对新烟碱类杀虫剂选择性的影响 53-69 1. 材料与方法 54-57 1.1 供试生物与化合物 54-55 1.2 表达载体构建与突变 55 1.3 体外转录 55 1.4 卵母细胞准备 55 1.5 电生理检测 55-56 1.6 受体模型 56-57 2. 结果与分析 57-66 2.1 拟环纹豹蛛D环对吡虫啉选择性的影响 59-61 2.2 拟环纹豹蛛E环对吡虫啉选择性的影响 61-63 2.3 拟环纹豹蛛F环对吡虫啉选择性的影响 63-64 2.4 拟环纹豹蛛D、E、F环对吡虫啉选择性的影响 64-65 2.5 受体模型 65-66 3. 讨论 66-69第四章拟环纹豹蛛烟碱型乙酰胆碱受体的亚基组成 69-79 1. 材料与方法 70-71 1.1 供试化合物 70 1.2 拟环纹豹蛛nAChRs亚基的异源表达及电生理检测 70 1.3 抗体制备与免疫共沉淀 70-71 1.4 放射性配基结合实验 71 2. 结果与分析 71-77 2.1 Ppα1与Ppα2亚基的共表达 71-73 2.2 内源性烟碱型乙酰胆碱受体亚基的免疫共沉淀 73-75 2.3 拟环纹豹蛛内源性nAChRs放射性结合实验 75-77 3. 讨论 77-79全文总结 79-81参考文献 81-93附录Ⅰ 昆虫nAChR亚基的GeneBank登录号 93-96附录Ⅱ 攻读硕士学位期间发表的学术论文 96-97致谢 97

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