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蛛网膜下腔出血脑淋巴引流途径阻滞后脑脊液对神经细胞的损伤及机制

作　者: 贾丽丽
导　师: 孙保亮
学　校: 泰山医学院
专　业: 老年医学
关键词: 蛛网膜下腔出血脑淋巴引流继发性脑缺血凋亡 PC12细胞海马神经元
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

研究背景:急性脑血管病是人类三大致死性疾病之一,其中蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)的发病率仅次于脑梗塞和脑出血,位居第三位。绝大多数SAH系脑动脉瘤破裂所致,其病死率高达25%以上,存活下来的患者约1/3因神经功能缺损而需要依赖他人生活,给社会和家庭带来沉重的负担。再出血和继发性脑缺血是导致SAH严重预后的两个主要并发症。目前对脑动脉瘤的闭塞术和血管内栓塞术取得了很大的进步,SAH后再出血率已显著降低,但其总体预后并没有显著改善。因此,深入探讨SAH后继发脑缺血损伤的机制,寻找有效防治措施是改善SAH预后的关键环节,具有十分重要的现实意义。数十年来,SAH后脑部主要动脉血管发生痉挛和管腔狭窄,即所谓脑血管痉挛(cerebral vasospasm, CVS)一直是研究的焦点问题。研究发现,SAH后CVS出现的时程和严重程度与继发性脑缺血损伤并不呈完全平行的关系。除CVS外,SAH后脑微循环痉挛和微循环调节功能异常等因素也与继发性脑缺血的发生有关。神经元的死亡可通过坏死(necrosis)和凋亡(apoptosis)两种不同形式发生。哺乳动物细胞凋亡是受Bcl-2蛋白家族、凋亡蛋白活化因子1(apoptosis protein activating factor, Apaf-1)、caspasse(胱冬肽酶)蛋白家族等调控的。通过大分子物质示踪等技术在不同种属动物包括人类的研究已经证实,脑内和蛛网膜下腔中的大分子物质可以被引流入颅外淋巴管和淋巴结。SAH继发脑缺血发生后,大量血浆蛋白等大分子物质可通过受损的血脑屏障进入脑组织中;由细胞受损而产生的细胞裂解产物和缺血代谢瀑布产生的大量肽类等大分子物质在脑中急剧增加,这些大分子物质需经淋巴引流出颅。目前脑淋巴引流途径对SAH继发性脑损伤的影响尚未见离体研究。研究目的:1、进一步阐明脑淋巴引流途径在病理条件下对脑组织大分子物质引流和神经元损伤的影响。2、探讨蛛网膜下腔出血脑淋巴引流途径阻滞后脑脊液对PC12细胞和原代海马神经元的损伤及有关机制。研究方法:1、选用健康成年新西兰大白兔,随机分为正常对照组、假手术对照组(SO)、SAH组、SAH+CLB组,每组10只。采用摘除颈部浅、深淋巴结并结扎其输入和输出淋巴管的方法建立脑淋巴引流阻滞(cerebral lymphatic blockage, CLB)模型,采用枕大池二次注血法建立SAH模型,假手术组给予枕大池注入等量生理盐水。于第二次枕大池注血后第5天,抽取脑脊液测定总蛋白(total protein, TP)及内皮素-1(endothelin-1, ET-1)的含量。取新鲜大脑冰冻切片,采用TUNEL荧光标记法检测大脑皮层和海马原位凋亡情况。2、于第二次枕大池注血后第5天抽取脑脊液分别加入PC12细胞、海马神经元培养基中,随机分为空白对照组(F12 /DMEM培养基),正常脑脊液组,SAH组,SAH+CLB组,分别于培养0.5h、1h、2h、4h后,检测细胞MTT和LDH释放率;采用免疫组化法检测细胞凋亡蛋白Bax、Hsp70等的表达;通过细胞骨架的免疫荧光定位检测细胞凋亡;采用流式细胞技术检测细胞的凋亡;采用激光共聚焦显微镜检测细胞内[Ca2+]、pH值的变化。研究结果:1、假手术组脑脊液中TP及ET-1与正常对照组比较,无显著性差异。SAH组及SAH+CLB组脑脊液中TP及ET-1的含量较正常对照组及SO组明显增加(P<0.01),且SAH+CLB组较SAH组升高明显(P<0.01)。2、TUNEL法原位细胞凋亡检测显示SAH组和SAH+CLB组均可见大量TUNEL阳性细胞,凋亡细胞多集中在大脑皮层、海马、基底节区、脉络丛、室管膜等部位,而以海马、皮层更为明显。其中SAH+CLB组表达更强,与SAH组比较有显著性意义(P<0.01)。3、(1)MTT、LDH结果显示与空白对照组比较,正常脑脊液对细胞无明显损伤作用;SAH组和SAH+CLB组脑脊液使细胞存活率降低,LDH释放率增加,且后者更加明显。(2)免疫组化结果显示SAH组和SAH+CLB组均有Bax、Hsp70、Caspase-3及Bcl-2蛋白表达,Bax及Caspase-3的表达量后者大于前者,且呈时间依赖性增强。而Hsp70和Bcl-2的表达在SAH组于2h时达高峰,SAH+CLB组于1h时达高峰,并随时间延长呈一动态变化趋势。(3)细胞骨架免疫荧光染色显示,空白对照组和正常脑脊液组细胞形态完整,胞浆及突起呈纤维束状绿染,粗细不等,胞核均质、完整。SAH组和SAH+CLB组细胞胞浆着色较弱,突起变短甚至回缩,胞核着色不均,可见核边聚深染,核碎裂及核小体出现。其中以SAH+CLB组更为明显。(4)流式细胞技术结果显示,空白对照组及正常脑脊液组几乎检测不到凋亡细胞,SAH+CLB组凋亡率大于SAH组,且具有显著性差异。(5)激光共聚焦技术检测结果显示,空白对照组及正常脑脊液组细胞内Ca2+、pH染色,荧光强度较弱,SAH组及SAH+CLB组较空白对照组明显增强,且SAH+CLB组高于SAH组,并具有显著性差异。研究结论:1、阻断脑淋巴引流途径能增加SAH后脑脊液TP、ET-1的浓度,并加重SAH后继发性脑损伤。2、阻断脑淋巴引流途径可以通过下调Bcl-2、Hsp70表达,上调Caspase-3、Bax表达来加重SAH脑脊液对PC12及原代培养海马神经元的损伤。3、阻断脑淋巴引流途径可以通过细胞内钙积聚,细胞内酸化加重SAH脑脊液对PC12及原代培养海马神经元的损伤。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
符号缩写说明  11-13
第一部分脑淋巴引流阻滞对SAH 后脑脊液总蛋白、内皮素含量及继发性脑缺血损伤的影响  13-33
  中文摘要  13-14
  英文摘要  14-15
  前言  15
  材料和方法  15-20
  结果  20-22
  讨论  22-26
  结论  26-27
  附图  27-30
  参考文献  30-33
第二部分脑淋巴引流阻滞对SAH 后脑脊液损伤PC12 细胞的影响  33-66
  中文摘要  33-34
  英文摘要  34-36
  前言  36
  材料和方法  36-43
  结果  43-49
  讨论  49-54
  结论  54-55
  附图  55-64
  参考文献  64-66
第三部分脑淋巴引流阻滞对SAH 后脑脊液损伤原代培养海马神经元的影响  66-95
  中文摘要  66-67
  英文摘要  67-69
  前言  69
  材料和方法  69-76
  结果  76-81
  讨论  81-85
  结论  85-86
  附图  86-94
  参考文献  94-95
综述：淋巴引流在脑脊液吸收和脑内大分子物质清除中的作用  95-104
  参考文献  100-104
致谢  104-105

蛛网膜下腔出血脑淋巴引流途径阻滞后脑脊液对神经细胞的损伤及机制

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