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毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因启动子的克隆和功能鉴定

作　者: 毛若雨
导　师: 黄建忠
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: γ-亚麻酸 △6脂肪酸脱饱和酶 启动子 增强子 报告基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 24次
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内容摘要


γ-亚麻酸(GLA)是广泛分布于自然界且对人体具有重要生理作用的一种多不饱和脂肪酸。Δ6-脂肪酸脱饱和酶是生物体合成GLA的关键限速酶,为进一步研究其基因的转录调控分子机制,通过衔接头PCR(LA-PCR),从Mucor sp.EIM-10中扩增得到1291 bp的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因5’端侧翼区域的单一产物,将序列在多个转录因子、启动子数据库中进行比对分析并应用多种计算机软件和多个启动子在线预测网站等进行分析,发现其具有真核启动子序列的基本结构特征,如具有CAAT盒、TATA框、GC盒等众多元件。本实验以构建好的穿梭载体PYGFP,PYESMCD6为基础构建启动子功能检测载体PYMCD6。将克隆得到的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因启动子插入PYMCD6,构建重组表达质粒PYMD6PMCD6。进一步发酵实验表明,当添加底物亚油酸(LA)后,含有Δ6-脂肪酸脱饱和酶启动子区域的重组酵母脂肪酸甲酯组分中出现GLA新峰,证明所获得的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因5’端侧翼区域能启动Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的表达。真核生物启动子区域中具有多种调控元件,且不同的基因具有不同的上游启动元件,其位置也不相同,这使得不同的基因表达分别有不同的调控机理。通过亚克隆技术得到不同长度的Mucor sp.EIM-10Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因启动子片段,并将其连入前文已构建的启动子功能检测载体PYMCD6,转化酿酒酵母尿嘧啶缺陷型菌株。筛选出阳性克隆后进行发酵试验并根据底物转化率分析其不同长度启动子片段的转录功能。结果表明含有不同长度启动子缺失片段(除了-121 bp)重组表达载体的重组酵母脂肪酸甲酯组分中均能够出现GLA新峰,底物转化率随着启动子长度的减少而逐渐降低。但若缺少了-919 bp～-784bp片段的启动子底物转化率会出现大幅度下降并且十分不稳定。这说明-919 bp～-784bp区域极有可能具有增强子作用。为进一步确定启动子区域中-919 bp～-784bp的增强子作用,利用重叠延伸PCR技术将Mucor sp.EIM-10Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因启动子中-919～-784 bp片段和只具有极低转化率的-434～-1 bp片段融合,并将融合片段插入前文已构建的启动子功能检测载体PYMCD6,构建重组表达载体PYOL94MCD6,转化酿酒酵母尿嘧啶缺陷型菌株INVScl后进行发酵实验。结果表明,当添加底物亚油酸(LA)后,含有启动子区域中-919～-784 bp和-434～-1 bp融合片段的重组酵母脂肪酸甲酯组分中出现GLA新峰,转化率达60%以上,明显高出只含有启动子区域中-434～-1 bp的转化率对启动子区域中-919～-784 bp片段的增强子功能做出了验证。

全文目录


摘要  2-4
Abstract  4-6
中文文摘  6-9
目录  9-13
第一章 绪论  13-33
  一 多不饱和脂肪酸  13-14
  二 γ-亚麻酸(GLA)  14-19
    2.1 γ-亚麻酸(GLA)的结构和理化性质  14
    2.2 γ-亚麻酸的生理、药理学功能  14-19
      2.2.1 对血栓形成的抑制作用  14-15
      2.2.2 调节脂质代谢  15
      2.2.3 降低心律失常发病率  15-16
      2.2.4 调节血糖作用  16
      2.2.5 抗肿瘤作用  16-17
      2.2.6 抗过敏和炎症作用  17-18
      2.2.7 对视神经和大脑发育的影响  18-19
  三 脂肪酸脱饱和酶研究进展  19-26
    3.1 脂肪酸脱饱和酶概况  19-20
    3.2 脂肪酸脱饱和酶的结构特点  20-21
    3.3 各种类型的脂肪酸脱饱和酶  21-26
      3.3.1 Δ4-脂肪酸脱饱和酶  21-22
      3.3.2 Δ5-脂肪酸脱饱和酶  22-23
      3.3.3 Δ6-脂肪酸脱饱和酶  23
      3.3.4 Δ9-脂肪酸脱饱和酶  23-25
      3.3.5 Δ12-脂肪酸脱饱和酶  25
      3.3.6 Δ15-脂肪酸脱饱和酶  25-26
  四 启动子  26-30
    4.1 启动子概述  26-29
      4.1.1 原核生物启动子  26-27
      4.1.2 真核生物启动子  27-29
    4.2 脂肪酸脱饱和酶启动子  29-30
  五 本课题的目的和意义  30-33
    5.1 目的  30-31
    5.2 意义  31-33
第二章 Δ6-脂肪酸脱饱和酶启动子的克隆与序列分析  33-41
  第一节 前言  33
  第二节 材料和方法  33-36
    2.1 材料  33-34
      2.1.1 菌株和质粒  33-34
      2.1.2 主要试剂和工具酶  34
      2.1.3 主要培养基  34
    2.2 方法  34-36
      2.2.1 基因组DNA的提取  34-35
      2.2.2 基因组DNA酶切与连接  35
      2.2.3 LA-PCR扩增  35-36
      2.2.4 测序和序列分析  36
  第三节 结果与分析  36-39
    3.1 Mucor sp.EIM-10基因组DNA的提取与酶切  36
    3.2 Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因5'端侧翼区域LA-PCR扩增  36-37
    3.3 LA-PCR产物的转化与筛选  37-38
    3.4 LA-PCR产物序列测定与序列分析  38-39
  第四节 小结与讨论  39-41
第三章 Δ6-脂肪酸脱饱和酶启动子的功能鉴定  41-49
  第一节 前言  41
  第二节 材料与方法  41-44
    2.1 材料  41-42
      2.1.1 菌株和质粒  41
      2.1.2 主要试剂和工具酶  41-42
      2.1.3 主要培养基  42
    2.2 方法  42-44
      2.2.1 表达载体PYMD6PMCD6的构建  42-44
      2.2.2 重组表达载体PYMD6PMCD6的表达  44
      2.2.3 基因表达产物的GC/MS分析  44
  第三节 结果与分析  44-47
    3.1 载体PYMCD6的构建  44-45
    3.2 载体PYMD6PMCD6的构建  45-46
    3.3 Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因启动子片段的功能鉴定  46-47
  第四节 小结与讨论  47-49
第四章 Δ6-脂肪酸脱饱和酶启动子缺失片段重组表达载体的构建和其转录活性的研究  49-61
  第一节 前言  49
  第二节 材料和方法  49-50
    2.1 材料  49-50
      2.1.1 菌株和质粒  49
      2.1.2 主要试剂和工具酶  49-50
      2.1.3 主要培养基  50
  2.2 方法  50-52
    2.2.1 启动子缺失片段重组表达载体的构建  50-51
    2.2.2 不同长度启动子缺失片段重组表达载体的表达  51
    2.2.3 基因表达产物的GC/MS分析  51-52
  第三节 结果与分析  52-59
    3.1 不同长度启动子缺失片段的亚克隆  52-53
    3.2 含有不同长度启动子缺失片段重组表达载体的构建  53-54
    3.3 不同长度启动子片段的起始转录功能鉴定  54-59
  第四节 小结与讨论  59-61
第五章 Δ6-脂肪酸脱饱和酶启动子区域-919～-784片段增强子功能验证和研究  61-71
  第一节 前言  61-62
  第二节 材料和方法  62-65
    2.1 材料  62-63
      2.1.1 菌株和质粒  62
      2.1.2 主要试剂和工具酶  62
      2.1.3 主要培养基  62-63
    2.2 方法  63-65
      2.2.1 表达载体PYOL94MCD6的构建  63-64
      2.2.2 表达载体PYOL94MCD6的表达  64
      2.2.3 基因表达产物的GC/MS分析  64-65
  第三节 结果与分析  65-70
    3.1 启动子区域-919～-784 bp和-434～-1 bp片段的PCR扩增  65
    3.2 启动子区域-919～-784 bp和-434～-1 bp融合片段的PCR扩增  65-66
    3.3 表达载体PYOL94MCD6的构建  66-67
    3.4 启动子中-919～-784 bp区域增强子功能的验证  67-70
  第四节 小结与讨论  70-71
结论  71-73
附录 主要缩略符号对照表  73-75
参考文献  75-87
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  87-89
致谢  89-91
个人简历  91-93

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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