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白假丝酵母菌的耐药分析及其与抗氰呼吸的相关性研究

作　者: 张晓梅
导　师: 马兴铭
学　校: 兰州大学
专　业: 免疫学
关键词: 白假丝酵母菌耐药性抗氰呼吸基因多态性
分类号: R379
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

白假丝酵母菌是一种最常见的条件致病性真菌,由于抗真菌药物的广泛应用,导致临床耐药菌株增加,关于白假丝酵母菌的耐药机制仍不完全清楚。抗氰呼吸是一种不受氰化物抑制的呼吸,普遍存在于许多植物和一些真菌、海藻中,在逆境胁迫下,植物的抗氰呼吸会增强。抗真菌药物作为白假丝酵母菌的一个逆境胁迫,是否会引起抗氰呼吸增强,目前国内外报道甚少。因此本实验通过选用兰州市区不同菌株的白假丝酵母菌测定其耐药情况、RAPD分型及抗氰呼吸,探讨白假丝酵母菌耐药情况及其与抗氰呼吸的相关性,为揭示白假丝酵母菌的耐药机制提供实验依据,对临床的治疗、诊断以及新药研制有一定的启示作用。从临床收集的37株白假丝酵母菌经过分离和鉴定证实为白假丝酵母菌。①用真菌药敏测定试剂盒测定37株白假丝酵母菌的耐药性,通过观察测定板上每孔颜色的变化判断结果；②随机引物PCR (RAPD-PCR)扩增20株白假丝酵母菌的DNA,GIS2010凝胶图像处理系统记录,分析RAPD带型与耐药性的相关性；③从中选出5株耐药菌株和5株敏感菌株,运用Clark型氧电极在30℃下测定抗氰呼吸；④用分光光度计测定氰化钾浓度为0、0.5mM、1.0 mM、2.0mM时对白假丝酵母菌生长的影响。实验数据用均数±标准差(x±S)表示,耐药组和敏感组菌株抗氰呼吸间的显著性差异采用了t检验, P<0.05被认为有显著性差异。实验结果如下：1.白假丝酵母菌药敏检测结果兰州市区白假丝酵母菌对益康唑的耐药率最高,达54.1%,对伊曲康唑的耐药率较低,为5.4%,对咪康唑和氟康唑的耐药率均为2.7%,其它3种药物无耐药,对3种抗真菌药物同时耐药的耐药率为5.4%。2. RAPD-PCR2种引物KIT A3和KIT A9对20株抗真菌药物耐药性不同的白假丝酵母菌进行PCR扩增,获得的RAPD带型稳定性好。引物KIT A3对20株白假丝酵母菌扩增出的RAPD带型共有5种,引物KIT A9扩增出的RAPD带型共有8种。耐药菌株和敏感菌株均显示出基因型的多态性,耐药性不同的白假丝酵母菌之间RAPD带型未见差异,说明白假丝酵母菌的耐药性与基因型之间无相关性。3.白假丝酵母菌的抗氰呼吸速率耐药白假丝酵母菌的抗氰呼吸速率均值为17.56±6.75nmol／min/OD620.,敏感白假丝酵母菌的抗氰呼吸速率均值为7.99±5.80nmol／min/O620,耐药白假丝酵母菌的抗氰呼吸速率明显升高；且耐药菌株抗氰呼吸速率占总呼吸的比例明显高于敏感菌株(P<0.05)；具有统计学意义。4.氰化钾对白假丝酵母菌的生长和耐药性的影响加入低浓度和中浓度氰化钾时,对白假丝酵母菌的生长影响不大,与不加氰化钾时相比较生长稍缓慢,对数期和平台期生长高峰略低；加入高浓度氰化钾时明显妨碍了白假丝酵母菌的生长,但菌的生长没有完全停滞,只是对数生长期延迟,生长高峰降低。1mM氰化钾存在时,耐药菌株和敏感菌株的耐药性均有增加,耐药变化率分别为60%和80%,但耐药组和敏感组耐药性的变化无统计学差异。实验结果表明：兰州市区分离的37株白假丝酵母菌,对益康唑耐药率最高,达54.1%,为兰州地区预防和控制耐药提供初步依据。白假丝酵母菌的DNA多态性较丰富,基因分型明确,且证实耐药性与RAPD带型之间没有相关性,说明耐药性的产生可能并非遗传所致。白假丝酵母菌耐药菌株的抗氰呼吸高于敏感菌株,且抗氰呼吸的诱导能够改变白假丝酵母菌的耐药性,说明白假丝酵母菌的耐药与抗氰呼吸途径相关,抗氰呼吸可能是白假丝酵母菌耐药的另一个新的机制。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
前言  10-14
实验材料  14-16
  1. 主要试剂  14
  2. 试验的试剂盒  14
  3. 实验试剂的配制  14-15
  4. 主要仪器  15-16
实验方法  16-20
  1. 菌株的分离与鉴定  16
  2. 药物敏感性测定  16-17
  3. 白假丝酵母菌DNA的提取  17-18
  4. RAPD-PCR反应  18
  5. 抗氰呼吸速率的测定  18-19
  6. 氰化钾对白假丝酵母菌生长的影响  19
  7. 氰化钾对白假丝酵母菌耐药性的影响  19
  8. 统计学方法  19-20
实验结果  20-32
  1 白假丝酵母菌的分离与鉴定结果  20
  2 白假丝酵母菌药敏检测结果  20-22
  3 RAPD-PCR结果  22-28
  4 白假丝酵母菌的抗氰呼吸速率测定  28-29
  5 氰化钾的存在对白假丝酵母菌生长的影响  29-30
  6 加氰化钾后对白假丝酵母菌耐药性的影响  30-32
讨论  32-36
结论  36-37
参考文献  37-40
医学综述  40-56
  参考文献  51-56
攻读学位期间发表的学位论文  56-57
致谢  57-58
英文缩略词表  58

白假丝酵母菌的耐药分析及其与抗氰呼吸的相关性研究

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