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人类新型冠状病毒NL63木瓜样蛋白酶生物学功能研究

作　者: 刘殿波
导　师: 张七斤；陈忠斌
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 人类新型冠状病毒 NL63木瓜样蛋白酶 泛素 去泛素化酶 干扰素
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本研究以人类新型冠状病毒NL63 (human coronavirus NL63, HCoV-NL63)木瓜样蛋白酶(papain-like protease, PLP)为研究对象,首先构建了木瓜样蛋白酶1 (papain-like protease 1, PLP1)的突变体D1225A和木瓜样蛋白酶2 (papain-like protease 2, PLP2)的突变体D1849A表达载体。通过Western Blotting技术证实,PLP1及其突变体C1062A、H1212A、D1225A对泛素(ubiquitin, Ub)分子不具有去泛素化(deubiquitinase, DUB)活性,PLP2却明显不同,野生型PLP2及突变体D1849A具有较强的DUB活性,而突变体C1678A、H1836A则丧失了此活性,同时对泛素样分子——干扰素刺激基因15(interferon stimulate gene 15, ISG15)进行检测,得到了相同的结论,提示PLP2的第1678位半胱氨酸和第1836位组氨酸是其DUB活性所必需的位点,第1849位天冬氨酸属于非必需位点。HCoV-NL63 PLP对宿主抗病毒天然免疫反应调控机制研究证实,PLP1及突变体C1062A、H1212A、D1225A均不能抑制干扰素-β(interferon-β, IFN-β)表达;PLP2和突变体D1849A却能强烈抑制IFN-β表达,但突变体C1678A、H1836却丧失了此功能。这表明,PLP2的干扰素拮抗活性与PLP2的DUB活性具有一定相关性。同时,对整个通路中关键蛋白调控的研究发现,PLP2与维甲酸诱导基因I (retinoic acid inducible gene I, RIG-I)、ERIS(endoplasmic reticulum IFN stimulator)相互作用,并利用自身的DUB活性特异性切除RIG-I、ERIS分子的多聚泛素化修饰,阻断其天然免疫反应,逃逸宿主防御系统。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-12
1 引言  12-20
  1.1 HCoV-NL63 的发现  12
  1.2 HCoV-NL63 基因组结构  12-13
  1.3 HCoV-NL63 感染与复制  13-14
    1.3.1 HCoV-NL63 与细胞受体结合  13-14
    1.3.2 HCoV-NL63 转录和复制  14
  1.4 HCoV-NL63 流行病学特点  14-15
    1.4.1 世界性分布  14-15
    1.4.2 流行季节  15
    1.4.3 混合感染  15
  1.5 HCoV-NL63 诊断  15-16
    1.5.1 反转录PCR 诊断(reversed transcript PCR,RT-PCR)  15-16
    1.5.2 实时荧光定量PCR 诊断(real-time PCR,RT-PCR)  16
    1.5.3 酶联免疫吸附法诊断(enzyme-linked Immunosorbent assays,ELISA)  16
  1.6 病毒与宿主抗病毒天然免疫反应的关系  16-19
    1.6.1 抗病毒天然免疫反应的概述  16-18
    1.6.2 病毒逃逸宿主免疫反应的新途径  18-19
  1.7 本研究目的和意义  19-20
2 实验(一)：HCoV-NL63 PLP 蛋白酶DUB 活性研究  20-39
  2.1 材料  21-22
    2.1.1 质粒和细胞  21
    2.1.2 设备  21
    2.1.3 试剂  21-22
    2.1.4 本实验自己配制试剂  22
  2.2 方法  22-30
    2.2.1 免疫荧光定位分析  22
    2.2.2 HCoV-NL63 PLP1 D1225A 和 PLP2 D1849A 表达载体的构建及鉴定  22-26
    2.2.3 细胞栽种  26
    2.2.4 细胞转染  26-27
    2.2.5 Western Blotting 检测  27-30
  2.3 结果  30-37
    2.3.1 HCoV-NL63 PLP1 和 PLP2 的定位  30-31
    2.3.2 HCoV-NL63 PLP1 D1225A 和 PLP2 D1849A PCR 产物  31
    2.3.3 HCoV-NL63 PLP1 D1225A 和 PLP2 D1849A 单克隆质粒  31-32
    2.3.4 单克隆质粒表达鉴定  32-33
    2.3.5 HCoV-NL63 PLP1 D1225A 和 PLP2 D1849A 测序结果  33
    2.3.6 HCoV-NL63 PLP1 及突变体对 Ub 的作用  33-34
    2.3.7 HCoV-NL63 PLP1 对 Ub 的 DUB 特异性检测  34
    2.3.8 HCoV-NL63 PLP2 及突变体对 Ub 的作用  34-35
    2.3.9 HCoV-NL63 PLP2 对 UbK48、UbK63 的作用  35-36
    2.3.10 HCoV-NL63 PLP2 及突变体对去 ISG15 活性研究  36
    2.3.11 HCoV-NL63 PLP2 去 ISG15 化活性的依赖性检测  36-37
  2.4 讨论  37-39
3 实验(二)：HCoV-NL63 PLP 蛋白酶对IFN 表达的调控  39-56
  3.1 材料  39-40
    3.1.1 质粒和细胞  39
    3.1.2 设备  39-40
    3.1.3 试剂  40
  3.2 方法  40-43
    3.2.1 荧光素酶报告基因检测  40-41
    3.2.2 免疫共沉淀技术检测  41-42
    3.2.3 免疫荧光技术检测PLP2 和ERIS 共定位  42-43
  3.3 结果  43-53
    3.3.1 HCoV-NL63 PLP1 及其突变体对 IFN-β通路的调控  43-44
    3.3.2 HCoV-NL63 PLP2 及突变体对 IFN-β通路的调控  44-45
    3.3.3 HCoV-NL63 PLP2 对 IRF-3 支路的调控  45-46
    3.3.4 HCoV-NL63 PLP2 对 NF-κB 支路的调控  46-47
    3.3.5 HCoV-NL63 PLP2 及突变体对 IFN-β总通路调控的特异性检测  47-48
    3.3.6 HCoV-NL63 PLP2 对 NF-κB 介导的 IFN 信号通路调控  48-49
    3.3.7 HCoV-NL63 PLP2 对 IRF-3 介导的 IFN 信号通路调控  49-50
    3.3.8 HCoV-NL63 PLP2 及突变体对免疫通路中关键位点的调控  50-51
    3.3.9 HCoV-NL63 PLP2 与 RIG-I 相互作用  51
    3.3.10 HCoV-NL63 PLP2 对 RIG-I 位点泛素化修饰的 DUB 活性检测  51-52
    3.3.11 HCoV-NL63 PLP2 与 ERIS 的相互作用  52
    3.3.12 HCoV-NL63 PLP2 与 ERIS 在细胞内的共定位  52
    3.3.13 HCoV-NL63 PLP2 对 ERIS 位点泛素化修饰的 DUB 活性检测  52-53
  3.4 讨论  53-56
4 结论  56-57
致谢  57-58
参考文献  58-65
附录  65-67
作者简介  67

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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