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CDK2泛素化降解在全反式维甲酸诱导急性髓性白血病细胞分化中的作用研究

作　者: 景慧
导　师: 何俏军；杨波
学　校: 浙江大学
专　业: 药学
关键词: 细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2) 急性髓性白血病(AML) 全反式维甲酸(ATRA) 泛素蛋白酶体系统(UPS) 细胞分化
分类号: R733.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究目的：急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)的重要标志为严重的髓系分化障碍,因此诱导分化治疗是目前公认的针对AML的有效治疗策略。利用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)(?)台疗早幼粒细胞白血病(acute promyeloid leukemia, APL, M3型AML)是诱导分化治疗策略用于临床实践的最成功范例。由于ATRA在临床应用上的巨大成功,深入研究ATRA诱导细胞分化的分子机制,进一步发现诱导分化治疗的潜在靶标,完善诱导分化治疗策略是许多肿瘤学家追求的重要目标。现代分子生物学研究发现ATRA诱导白血病细胞分化过程中往往伴随有细胞退出增殖周期,即细胞周期阻滞于G0/G1期。因此细胞周期调控因子在ATRA诱导分化中的作用成为该领域的研究热点之一。根据现有文献报道,细胞周期蛋白依赖激酶活化激酶(Cyclin-dependent kinase-activating kinase, CAK)、细胞周期蛋白D1 (Cycli D1), P21 WAF1/Cip-1、P27 Kipl和Cyclin E等都被认为在ATRA诱导细胞分化过程中发挥重要作用。但细胞周期蛋白依赖激酶(Cyclin-dependent kinases, CDKs)是否在该过程中发挥作用目前仍无文献报道。细胞周期蛋白依赖激酶2(Cyclin-dependent kinase 2, CDK2)属于CDK丝氨酸/苏氨酸激酶家族,是细胞G1/S期转换过程中的重要调控因子。CDK2可分别结合于Cyclin E和Cyclin A,随后CAK磷酸化其苏氨酸160位(Thr-160)而被激活,通过磷酸化众多底物而促进G1/S期的进程。然而除在细胞周期中发挥重要作用外,近年来CDK2也被发现在调控细胞自我更新和分化中起到关键作用。一些文献报道CDK2活性或表达可促进鼠神经母细胞瘤细胞、胚胎干细胞、小鼠中枢神经系统祖细胞和成年小鼠的髓鞘等的分化。泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)是真核细胞内蛋白质选择性降解的重要途径。通过选择性降解并调控细胞内蛋白,UPS广泛地参与细胞的生长、分化、凋亡、周期调控、炎症反应等重要的生命活动过程。本课题组前期研究发现,ATRA诱导AML细胞分化和G0/G1周期阻滞的过程中伴随有CDK2蛋白水平的明显下降,而同时抑制蛋白酶体活性,CDK2下调的趋势被明显逆转,提示CDK2在ATRA作用后可能通过UPS发生降解。关于CDK2的降解机制及其在ATRA诱导细胞分化中的作用目前均尚无文献报道。因此,本课题的研究将分两部分探讨ATRA诱导AML细胞分化中UPS介导的CDK2的降解：1)确证ATRA促进CDK2通过UPS发生降解,并探讨其调控机制；2)研究CDK2降解对ATRA诱导AML细胞分化的影响,并探索相关分子机制。研究方法：1)选用人白血病细胞株NB4和U937为主要研究对象,考察ATRA诱导细胞分化过程中CDK2泛素化降解的情况：细胞经CD11b-PE抗体孵育后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b表达；应用瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学改变；应用碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色结合流式细胞术检测细胞周期分布；应用Real-time PCR检测细胞中CDK2 mRNA水平变化；应用western-blot检测CDK2及P-CDK2 (Thr-160)蛋白水平变化；应用免疫荧光法检测细胞内CDK2与泛素蛋白(Ubiquitin, Ub)的共定位变化；采用免疫沉淀法检测CDK2与Ub的结合水平；选用COS-7细胞为瞬时表达宿主,共转染CDK2/CDK2-T160A和Ub考察CDK2和CDK2-T160A的泛素化降解情况。采用TNT(?)兔网织红细胞裂解液转录/翻译偶联系统体外表达CDK2重组蛋白。2)选用人AML细胞株NB4为主要研究对象,考察细胞内CDK2蛋白水平下降对ATRA诱导AML细胞分化作用的影响：采用台盼蓝染色结合血细胞计数板计数观察细胞增殖情况和细胞存活率,描绘细胞增殖曲线；细胞经CD11b-PE抗体孵育后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CDllb表达；应用瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学改变；采用硝基四氮唑蓝(NBT)测试细胞还原能力；采用PI染色结合流式细胞术检测细胞周期分布的变化；应用western-blot检测CDK2蛋白,细胞周期蛋白(CyclinE、Cyclin A),分化相关转录因子的表达(p-STAT1 Try701、STAT1、PU.1、C/EBPβ)的表达情况；应用Real-time PCR检测细胞内以上蛋白和粒性细胞特异性表达的CSF3R的mRNA表达水平。研究结果：第一部分：ATRA促进CDK2通过泛素蛋白酶体途径降解1)药物诱导AML细胞分化和G0/G1期阻滞过程中CDK2发生明显下调检测细胞分化特异性表面抗原CDllb的表达,结果显示ATRA能够诱导NB4和U937细胞发生髓系分化,且呈时间依赖性关系。瑞氏-吉姆萨染色结果表明ATRA作用72小时后,NB4细胞分化为成熟粒细胞,U937细胞分化为成熟单核/巨噬细胞。PI染色结合流式细胞术的检测发现,ATRA能够诱导NB4细胞和U937细胞发生时间依赖性的G0/G1期阻滞。Western-blot检测结果显示,ATRA作用后,NB4细胞和U937细胞中CDK2蛋白水平呈现逐渐下调趋势,且与细胞的分化和周期阻滞进程高度一致。此外,在TPA和DMSO诱导NB4细胞分化和G0/G1期阻滞的过程中,CDK2蛋白水平亦发生明显下调,而采用周期同步化手段使细胞分布于不同周期阶段时CDK2水平则无明显变化,进一步提示CDK2蛋白下调与ATRA诱导AML细胞分化之间的密切关系。2)AML细胞分化过程中CDK2的下调依赖于蛋白酶体通路Real-time PCR检测结果显示ATRA作用后,NB4细胞中CDK2 mRNA水平略微下调,而U937细胞中CDK2 mRNA则无明显变化,同时TPA和DMSO作用后,NB4细胞中CDK2 mRNA水平亦无显著变化,提示CDK蛋白的减少主要是由于降解的增多而导致的。Western-blot的结果表明溶酶体抑制剂的作用对ATRA引起的CDK2蛋白的降解无影响,而蛋白酶体抑制剂则能显著逆转ATRA导致的CDK2降解；同时Real-time PCR结果证实蛋白酶体抑制剂通过直接抑制CDK2的降解而发挥作用,表明蛋白酶体途径参与了AML细胞分化过程中CDK2的降解这一结果。3)CDK2在不同体系中通过泛素蛋白酶体途径发生降解在COS-7细胞中共转染CDK2和Ub的表达质粒,免疫沉淀结合western-blot的结果显示COS-7细胞中CDK2-HA可与GFP-Ub结合,且二者的结合能够被蛋白酶体抑制剂累积；同时GFP-Ub表达增多促进CDK2-HA蛋白的降解,而蛋白酶体抑制剂可抑制该降解,表明COS-7细胞中外源性表达的CDK2可被外源性表达的Ub标记,继而通过蛋白酶体发生降解。在未经处理的兔网织红细胞裂解液(Rabbit reticulocyte lysate, RRL)体系中观察体外条件下CDK2的泛素化,免疫沉淀结果显示COS-7细胞中表达的CDK2-HA蛋白可在RRL中发生泛素化,体外表达的CDK2融合蛋白亦能够在RRL中发生泛素化并被蛋白酶体所降解。该结果进一步证实在CDK2可作为UPS途径的底物而被降解。4) ATRA诱导AML细胞分化过程中促进CDK2通过UPS途径降解免疫荧光检测的结果表明ATRA作用后,NB4细胞中CDK2的荧光强度逐渐减弱,而Ub的荧光强度则逐渐增强,同时CDK2与Ub的共定位点亦呈时间依赖性增加。免疫沉淀结合western-blot的检测结果进一步证实随ATRA作用时间延长,NB4和U937细胞中CDK2的相对泛素化水平均显著增加,表明在NB4细胞中CDK2可能可以与泛素结合,并且ATRA能够促进二者的结合增加。5)CDK2的160位点苏氨酸磷酸化水平对CDK2泛素化的影响Western-blot检测发现ATRA作用后,NB4和U937细胞中p-CDK2 (Thr-160)的下调程度和速度较CDK2总蛋白都更为明显,提示ATRA作用后CDK2在Thr-160位磷酸化水平的降低可能可以促进CDK2发生泛素化进而被蛋白酶体所降解。利用点突变实验构建Thr-160位点低磷酸化状态的CDK2突变体(Threonine突变为Alanine, CDK2-T160A),通过免疫沉淀结合western-blot观察COS-7细胞中外源性表达的CDK2-HA及CDK2-T160A-HA与GFP-Ub的结合,结果发现CDK2-T160A-HA的泛素化水平较CDK2-HA显著增加,同时MG132作用后CDK2-T160A-HA泛素化水平的累积也明显高于CDK2-HA.在RRL体外泛素化体系的实验也表明CDK2-T160A-HA的泛素化水平高于CDK2-HA。最后,给予蛋白合成抑制剂后通过western-blot法检测CDK2蛋白半衰期,结果显示CDK2-HA在COS-7细胞中的半衰期约为3.4小时,而CDK2-T160A-HA的半衰期则显著缩短至1.8小时左右。上述结果表明CDK2 Thr-160位点磷酸水平的降低能够促进CDK2通过UPS途径的降解,而ATRA可能通过降低CDK2 Thr-160位的磷酸化水平而引起CDK2通过UPS途径发生降解。第二部分：CDK2降解在全反式维甲酸诱导急性髓性白血病细胞分化中的作用及机制研究1)CDK2蛋白水平的下降增强ATRA诱导AML细胞分化的作用利用慢病毒转染技术将携带CDK2 shRNA的质粒pLKO.l-CDK2#1 shRNA和pLKO.1-CDK2#5shRNA以及相应的质粒空载pLKO.1 (Vector)转入NB4细胞,筛选并构建稳定表达的细胞株。Western-blot检测结果显示与质粒空载相比,pLKO.1-CDK2#1 shRNA的沉默CDK2表达的效率接近100%,pLKO.1-CDK2 #5 shRNA的沉默效率约为60%。用细胞增殖抑制率、分子标志、细胞形态学、生化特性等指标观察ATRA诱导NB4-Vector、NB4-CDK2#1 shRNA和NB4- CDK2#5 shRNA细胞分化成熟度的能力。结果显示ATRA (5 nM)作用72小时后,对以上三株稳定细胞的增殖抑制率分别为19.00%、55.12%和36.95%。对NB4-Vector和NB4- CDK2 #1 shRNA绘制细胞增殖曲线的结果表明,无ATRA作用的情况下NB4-Vector和NB4- CDK2 #1 shRNA细胞增殖无显著差异,而ATRA对NB4-CDK2 #1 shRNA细胞增殖速率的抑制强于对NB4-Vector细胞的抑制作用。流式细胞术分析细胞表面CDllb表达的结果显示,ATRA作用后NB4-Vector、NB4-CDK2 #1 shRNA和NB4- CDK2 #5shRNA细胞中的CDllb阳性率分别为51.80%,76.28%和66.44%。上述结果表明,NB4细胞中CDK2蛋白水平下降能够显著促进ATRA引起的增殖抑制和CDllb表达增加,且这种促进作用随CDK2蛋白下调程度的增加而增加。选取CDK2沉默效率较高的NB4-CDK2 #1 shRNA(下文称为NB4-CDK2 shRNA)和NB4-Vector细胞进行后续实验。NBT还原实验的结果显示ATRA作用后,NB4-Vector细胞中NBT阳性细胞比例为59.61%,NB4-CDK2 shRNA中NBT阳性细胞的比例则为85.34%。Real-time PCR检测粒细胞特异性的集落刺激因子3受体(colony stimulating factor 3 receptor, CSF3R)的1mRNA水平,ATRA作用后,NB4-CDK2 shRNA细胞中CSF3R mRNA水平的增加明显强于NB4-Vector细胞。瑞氏-吉姆萨染色结果表明,ATRA作用后NB4-Vector和NB4-CDK2 shRNA细胞形态呈现粒性分化特征,即细胞核质比减少,细胞核呈现明显的分叶状,并且NB4-CDK2 shRNA细胞分叶核细胞的比例明显高于NB4-Vector细胞。以上结果从细胞表明抗原表达,细胞功能以及形态学三方面证实了细胞内CDK2蛋白水平降低能够显著促进ATRA诱导NB4细胞粒性分化的作用。2)CDK2蛋白水平下调协同ATRA诱导AML细胞分化的机制研究细胞周期同步化实验结合流式细胞术检测细胞周期分布的结果显示,NB4-Vector和NB4-CDK2 shRNA细胞在同步化后细胞周期G0/G1、S、G2/M的进程均无明显差异,表明CDK2蛋白水平的下调并不影响NB4细胞的周期进程。ATRA作用于NB4-Vector和NB4-CDK2 shRNA细胞后不同时间检测细胞周期分布,发现两组细胞均出现明显的G0/G1期阻滞,但无论在ATRA处理前或处理后,二者的周期分布情况无显著差异。上述结果表明,细胞内CDK2蛋白水平的下降对NB4细胞的细胞周期无影响,同时对ATRA诱导NB4细胞G0/G1阻滞的作用亦无影响,提示CDK2蛋白下调所引起的ATRA诱导细胞分化作用的增强并非由其促进细胞周期阻滞的作用引起。Real-time PCR的结果显示,ATRA作用12和24小时后,NB4-Vector细胞中PU.1、C/EBPβf、STAT1的mRNA水平逐渐上调；而在NB4-CDK2 shRNA细胞中,ATRA上调或下调以上蛋白mRNA表达的作用显著增强。Western-blot结果显示ATRA作用48小时后,PU.1、C/EBPβ. STAT1、p-STAT (Tyr-701, STAT1的活性形式)在NB4-Vector和NB4-CDK2 shRNA细胞中均发生明显上调,并且在后者中的上调程度大于前者；检测细胞核中以上蛋白的含量后发现,NB4-CDK2 shRNA中PU.1, C/EBPβ. STAT1、p-STAT随ATRA作用时间逐渐增加的核转较NB4-Vector细胞当中更为明显。以上结果表明,CDK2蛋白水平下降所引起的ATRA诱导AML细胞分化作用的增加可能是通过促进ATRA对分化相关转录因子网络的调控而实现的。结论：本论文较为系统的探讨了ATRA分化诱导治疗AML过程中UPS介导的CDK2降解,并对其作用和相关机制进行了探讨。首先,我们首次证实CDK2可作为UPS途径的底物而被降解,ATRA在诱导AML细胞分化过程中促进CDK2通过UPS途径发生降解。其次,CDK2的降解能够促进ATRA诱导AML细胞分化的作用,且这种促进作用并非由促进细胞退出增殖周期所介导,而是通过直接调控分化相关转录因子的信号网络而实现。本文阐述了CDK2在AML细胞分化过程中的全新调控方式和功能,为进一步完善和开发新型的白血病分化诱导治疗策略提供了理论基础。

全文目录

致谢  4-5
中文摘要  5-12
Abstract  12-22
绪论  22-25
第一部分全反式维甲酸促进CDK2泛素化降解及机制研究  25-65
  1.1 引言  25-27
  1.2 实验材料与仪器  27-32
    1.2.1 细胞株和质粒  27
    1.2.2 药物与主要试剂  27-30
    1.2.3 仪器  30-32
  1.3 实验方法  32-39
    1.3.1 细胞培养  32
    1.3.2 流式细胞术检测NB4和U937细胞表面分化抗原CD11b表达情况  32
    1.3.3 吉姆萨染色观察AML细胞核形态变化  32
    1.3.4 细胞周期检测  32-33
    1.3.5 Western Blotting检测相关蛋白  33-34
    1.3.6 Real-time PCR测定细胞相关基因表达水平的变化  34-35
    1.3.7 免疫荧光法观察CDK2和Ub在细胞内的共定位情况  35-36
    1.3.8 免疫沉淀检测CDK2和Ub相互作用  36
    1.3.9 pET-28b-CDK2-HA质粒构建  36
    1.3.10 pCMV-neo-Bam-CDK2(T160A)-HA质粒点突变  36-37
    1.3.11 脂质体转染  37
    1.3.12 体外表达重组CDK2蛋白  37-38
    1.3.13 体外泛素化降解实验  38
    1.3.14 数据分析  38-39
  1.4 实验结果  39-63
    1.4.1 药物诱导AML细胞分化和G0/G1期阻滞过程中CDK2发生明显下调  39-45
    1.4.2 AML细胞分化过程中CDK2的下调依赖于蛋白酶体通路  45-49
    1.4.3 CDK2在不同体系中通过泛素蛋白酶体途径发生降解  49-54
    1.4.4 ATRA诱导AML细胞分化过程中促进CDK2通过UPS途径降解  54-57
    1.4.5 CDK2苏氨酸160位点磷酸化水平对CDK2泛素化的影响  57-63
  1.5 讨论  63-65
第二部分 CDK2降解在全反式维甲酸诱导急性髓性白血病细胞分化中的作用及机制研究  65-91
  2.1 引言  65-68
  2.2 实验材料与仪器  68-70
    2.2.1 细胞株和质粒  68
    2.2.2 药物与主要试剂  68-69
    2.2.3 仪器  69-70
  2.3 实验方法  70-74
    2.3.1 细胞培养  70
    2.3.2 台盼蓝拒染法检测细胞增殖活性  70
    2.3.3 NBT细胞还原能力测定  70
    2.3.4 流式细胞术检测细胞表面CD11b分化抗原表达情况  70
    2.3.5 吉姆萨染色观察细胞核形态变化  70-71
    2.3.6 流式细胞术检测细胞周期分布情况  71
    2.3.7 Real-time PCR检测细胞内相关基因表达水平  71
    2.3.8 Western-blot检测相关蛋白  71
    2.3.9 脂质体转染  71
    2.3.10 慢病毒颗粒的包装、滴度测定及细胞转染  71-73
    2.3.11 制备核抽提样本  73
    2.3.12 数据分析  73-74
  2.4 实验结果  74-88
    2.4.1 shRNA-CDK2质粒转染对COS-7细胞CDK2表达水平的影响  74
    2.4.2 CDK2蛋白水平下降对ATRA诱导AML细胞分化的影响  74-79
    2.4.3 CDK2蛋白水平下调协同ATRA诱导AML细胞分化的机制研究  79-88
  参考文献  88-91
综述  91-109
  1. 髓系细胞发育过程中的重要转录因子  91-97
  2. 转录因子失调与髓性白血病  97-101
  3. 转录因子和肿瘤治疗  101-104
  参考文献  104-109
作者简历及在学期间所取得的科研成果  109-111

CDK2泛素化降解在全反式维甲酸诱导急性髓性白血病细胞分化中的作用研究

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