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组蛋白H2B泛素化修饰在减数分裂过程中作用的初步研究
作 者: 涂华玉
导 师: 李卫
学 校: 中国科学技术大学
专 业: 遗传学
关键词: 组蛋白H2B 泛素化 去泛素化 基因敲除 减数分裂
分类号: Q343
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
组蛋白翻译后修饰包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化和糖基化等。这些翻译后修饰在染色质的结构重塑、基因的转录调控、DNA的损伤修复等生命过程中发挥着极其重要的作用。作为染色质的核心蛋白,组蛋白H2B的泛素化与其他组蛋白修饰之间存在密切联系,是"组蛋白密码"多样性的重要一环。H2B的泛素化是一个由一系列事件构成的过程,许多因子都参与和影响着该过程。目前发现芽殖酵母中H2B泛素化需要Rad6、Bre1、Lge1以蛋白复合体的形式参与其催化过程,而Ubp8、Ubp10是细胞内参与H2B去泛素化的两种主要去泛素化酶,其去泛素化活性亦是相互补充的。研究表明Lge1在对募集Bre1和Ubp8至染色质的过程中发挥相反作用,它能促进Bre1的募集却抑制Ubp8的募集。组蛋白修饰在配子体的发生尤其早期减数分裂过程中扮演了重要的角色,H2B泛素化修饰已被证明参与其中,但是H2B的泛素化和去泛素化究竟发挥了什么样的作用,又是如何调节其下游的一系列表观遗传学过程进而影响减数分裂的还并不清楚。为了了解组蛋白H2B的泛素化修饰在减数分裂过程中的作用机制问题,我们围绕着H2B泛素化修饰相关的几种主要蛋白Bre1、Lge1、Ubp8、Ubp10从以下方面进行研究:1.我们建立H2B泛素化相关蛋白的C端融合GFP的酵母细胞系,然后通过荧光显微镜观察Bre1、Lge1定位于细胞核内。2.构建相应的基因特异性敲除的酵母菌株,观察其对减数分裂进程的影响,研究证实Bre1、Lge1基因的敲除会影响酵母的减数分裂,显著降低芽殖酵母的产孢率,而Ubp8、Ubp10去泛素化酶的双突变对酵母减数分裂影响并不显著。3.构建组蛋白H2B泛素化位点的突变体(H2B K123R),以研究H2BK123位点泛素化在减数分裂中作用。4.构建了特异敲除H2B泛素化酶Rnf20(酵母中Bre1的同源物)的基因敲除载体,获得了第一代嵌合体小鼠,为进一步构建在睾丸和卵巢中特异敲除Rnf20的小鼠系做准备,从而通过H2B泛素化酶Rnf20敲除小鼠去研究其在睾丸和卵巢中的功能。通过上述实验,我们发现H2B的泛素化修饰影响了减数分裂的进程,为进一步阐明H2B的泛素化修饰在减数分裂过程中的作用机制问题奠定了基础。
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全文目录
摘要 4-5 英文摘要 5-8 第一章 绪论 8-23 1.1 配子发生与表观遗传修饰 8-10 1.2 组蛋白H2B 的泛素化与去泛素化修饰 10-14 1.2.1 蛋白质泛素化与组蛋白泛素化 10-11 1.2.2 组蛋白H2B 的泛素化 11-12 1.2.3 组蛋白H2B 的去泛素化 12-14 1.3 组蛋白泛素化修饰与其他组蛋白修饰之间的关系 14-15 1.4 组蛋白修饰参与在减数分裂过程当中 15-18 1.5 基因敲除简介 18-23 1.5.1 酵母基因敲除简介 18-19 1.5.2 小鼠基因敲除简介 19-23 第二章 实验材料与方法 23-43 2.1 实验器材 23-24 2.2 实验材料 24-25 2.2.1 菌株 24-25 2.2.2 质粒载体 25 2.3 实验常用试剂、溶液、培养基 25-27 2.3.1 常用实验试剂 25-26 2.3.2 实验常用溶液 26 2.3.3 实验常用培养基 26-27 2.4 实验技术与方法 27-43 2.4.1 酵母基因敲除和C 端添加GFP 27-30 2.4.2 酵母二倍体的获取 30-31 2.4.3 SK1 酵母菌的产孢分析 31-32 2.4.4 酵母的毒性筛选实验 32 2.4.5 定点突变 32-35 2.4.6 蛋白表达鉴定分析 35-36 2.4.7 特异性基因敲除小鼠构建 36-43 第三章 实验结果与讨论 43-56 3.1 实验结果 43-53 3.1.1 H2B 泛素化相关蛋白Bre1,Lge1 的定位 43-44 3.1.2 H2B 泛素化相关蛋白敲除对酵母产孢的影响 44-47 3.1.3 构建H2BK123R 酵母突变系 47-49 3.1.4 构建Rnf20 特异性敲除小鼠 49-53 3.2 讨论 53-56 参考文献 56-63 附录 63-68 致谢 68
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中图分类: > 生物科学 > 遗传学 > 遗传学分支学科 > 细胞遗传学
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