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降温诱导改善猪α-干扰素发酵生产性能和ATP再生效率

作　者: 刘国强
导　师: 史仲平
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 毕赤酵母低温 ATP 代谢通量甲醇比消耗速度猪α干扰素
分类号: TQ929.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本论文以重组毕赤酵母(Pichia psatoris)KM71H(IFNα-pPICZαA)菌株为模式菌株,在摇瓶和10L发酵罐的条件下表达猪α干扰素(pIFN-α),考察了环境因素对pIFN-α浓度和抗病毒活性的影响。摇瓶实验结果表明,温度对pIFN-α的发酵性能影响显著。在10L发酵罐中,通过监测发酵过程状态参数,结合毕赤酵母利用甲醇的简化代谢模型,全面分析了温度对pIFN-α生产性能的影响。论文的主要研究内容与结果如下:(1)选取诱导温度、甲醇诱导浓度和pH为考察因子,设计实验方案,利用摇瓶培养毕赤酵母生产表达pIFN-α。诱导72h,上清液SDS-PAGE电泳分析结果表明,20℃低温诱导下的pIFN-α蛋白条带明显粗于30℃诱导的条带,说明低温诱导有利于pIFN-α的表达生产。利用凝胶图像分析仪扫描图像,诱导温度20℃、甲醇浓度20g/L、pH=5.5条件下,最高pIFN-α浓度可达0.19g/L。(2)在10L发酵罐和不同诱导温度下,进行了毕赤酵母高密度培养生产pIFN-α的发酵实验。运用工业生产中普遍使用的在线监测仪器,在线监测发酵过程的状态参数(甲醇比消耗速度、耗氧速度OUR、CO2生成速度CER、呼吸商RQ),发现不同诱导温度下上述参数存在较大差异。20℃时,细胞代谢活性高,甲醇比消耗速度快。结合使用细胞利用甲醇时的简化代谢模型进行代谢分析,结果表明,改变诱导温度可以导致胞内产能途径(途径A)和目标物质合成途径(途径B)的代谢流分配比例的改变。20℃下的低温诱导强化了走向pIFN-α合成途径的碳代谢流通量,与30℃诱导相比,发酵90 h时该代谢通量比例增加了67%。(3)使用普遍认可的以甲醇为底物的毕赤酵母简化代谢模型,结合发酵过程状态参数的在线测量,以及胞内氧化磷酸化途径中相关酶(NADH/NAD+)和高能磷酸化合物(ATP、ADP、AMP)的检测,对pIFN-α表达生产体系的能量运转机制进行了研究。计算分析表明,20℃低温诱导条件下,产能途径中所生成的NADH可以在产物合成途径中得到有效利用,产物合成途径中所需ATP的能量再生效率有所提高,ATP再生速度增加了6-24%,毕赤酵母发酵生产外源蛋白的整体效率得到改善。(4)10L发酵罐20℃诱导条件下的最高pIFN-α活性可达1.5×106IU/mL,是同体积发酵罐30℃诱导生产时最高活性(1×104IU/mL)的150倍。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 绪论  8-14
  1.1 干扰素概述  8-9
    1.1.1 干扰素定义及理化特性  8
    1.1.2 干扰素的功能及作用机制  8-9
  1.2 毕赤酵母表达系统简介  9-10
  1.3 猪α干扰素的研究近况  10-11
  1.4 本文中猪α干扰素的基因结构及氨基酸组成  11-12
  1.5 立题依据及意义  12-13
  1.6 主要研究内容  13-14
2 材料与方法  14-22
  2.1 材料和仪器  14-15
    2.1.1 实验菌种  14
    2.1.2 毕赤酵母发酵培养基  14
    2.1.3 WISH 细胞和VSV 病毒  14
    2.1.4 干扰素活性检测培养基  14-15
    2.1.5 主要实验仪器  15
  2.2 培养及诱导方法  15-17
    2.2.1 种子扩培  15
    2.2.2 摇瓶诱导  15-16
    2.2.3 10L 罐发酵培养  16
    2.2.4 WISH 细胞的活化及传代扩培  16-17
    2.2.5 VSV 病毒的培养  17
  2.3 检测方法  17-22
    2.3.1 甲醇浓度的离线检测  17
    2.3.2 甲醇浓度的在线检测  17
    2.3.3 菌体浓度的检测  17-18
    2.3.4 发酵状态参数的在线监测  18
    2.3.5 目的蛋白(pIFN-α)的分析  18
    2.3.6 总蛋白浓度的检测  18-19
    2.3.7 pIFN-α抗病毒活性的检测  19
    2.3.8 胞内能荷及氧化还原态的检测  19-20
    2.3.9 AOX 酶活检测  20-22
3 结果与讨论  22-37
  3.1 毕赤酵母诱导期摇瓶实验中环境因素的优化  22-24
    3.1.1 不同环境条件下的目的蛋白产量  22-23
    3.1.2 摇瓶结果的多因素方差分析  23-24
  3.2 10L 发酵罐中温度对毕赤酵母表达pIFN-α发酵性能的影响  24-30
    3.2.1 甲醇在毕赤酵母中的代谢图  24-25
    3.2.2 温度对菌体生长、甲醇代谢及蛋白表达的影响  25-27
    3.2.3 甲醇浓度一定，不同批次、不同温度下的呼吸代谢特征  27-28
    3.2.4 同批次发酵、分时段改变诱导温度条件下的pIFN-α生产和细胞代谢特征的变化模式  28-29
    3.2.5 20℃发酵实验的重复性验证  29
    3.2.6 小结  29-30
  3.3 20℃低温诱导策略对ATP 再生效率和发酵能耗的影响  30-35
    3.3.1 不同诱导温度下的ATP 再生效率  30-32
    3.3.2 ATP、ADP、AMP、NADH、NAD+的测量方法及不同诱导温度下胞内能荷及氧化还原水平的状态  32-34
    3.3.3 低温诱导策略缓解毕赤酵母高密度培养生产外源蛋白时的高能耗特征  34-35
    3.3.4 小结  35
  3.4 结论与展望  35-37
    3.4.1 结论  35-36
    3.4.2 展望  36-37
致谢  37-38
参考文献  38-42
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  42

降温诱导改善猪α-干扰素发酵生产性能和ATP再生效率

内容摘要

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