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酵母双杂交、免疫共沉淀研究禽传染性支气管炎病毒S1、M蛋白相互作用

作　者: 封浪
导　师: 王红宁
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽传染性支气管炎 S1蛋白 M蛋白酵母双杂交免疫共沉淀相互作用
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

禽传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由冠状病毒科冠状病毒属的禽传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病。S1蛋白是病毒主要抗原蛋白,决定病毒的血清型,现已被证实是诱导病毒中和抗体及血凝抗体产生的蛋白。研究表明,M-蛋白位于病毒外表面,是含量最丰富的结构蛋白,M蛋白的作用与病毒的复制有关,且控制并介导病毒粒子从粗面内质网(RER)和高尔基体膜出芽。M蛋白在细胞内聚集是蛋白质本身的性质,在细胞内聚集的地方很可能是病毒组装成熟和出芽的位点。但目前关于IBV的S1蛋白和M蛋白之间是否存在相互作用尚未见报道。因此研究IBV中S1蛋白和M蛋白之间是否存在相互作用对研究IBV病毒的侵入机制具有重要意义。采用PCR技术从肾型禽传染性支气管炎病毒SAIBk毒株基因组中克隆S1与M基因,并分别克隆到酵母双杂交载体质粒上,构建重组质粒PGBKT7-S1和PGADT7-Rec-M,测序结果表明,成功构建了重组质粒PGBKT7-S1和PGADT7-Rec-M,采用醋酸锂法顺序转染酵母菌AH109,进行阳性克隆筛选,排除假阳性。通过检测lacZ报告基因表达产物β-半乳糖苷酶活性实验进行阳性克隆的鉴定。PGBKT7-S1和PGADT7-Rec-M顺序转化的酵母菌AH109可以使浸润的硝酸纤维素膜变蓝,说明报告基因LacZ被激活表达,证明S1蛋白和M蛋白存在相互作用。利用免疫共沉淀技术进一步验证S1蛋白和M蛋白间的相互作用,构建带HA标签的S1融合蛋白(HA-S1)的重组表达载体pCMV-HA-S1,和带Myc标签的M融合蛋白(Myc-M)的重组表达载体pCMV-Myc-M,共同转染HEK293细胞。抗Myc单克隆抗体沉淀Myc-M相互作用蛋白复合物后,用抗Myc单克隆抗体进行Western blot检测,可以检测到Myc-M的表达,证明S1蛋白和M蛋白存在相互作用。运用生物信息学分析表明S1蛋白二级结构、M蛋白二级结构,推测S1与M蛋白可能在亲水性较强的柔性区域发生了相互作用本研究采用酵母双杂交和免疫共沉淀方法研究证明了IBV S1蛋白与M蛋白间存在相互作用,IBV S1蛋白与M蛋白的相互作用在国内外未见报道,丰富了IBV的生物特性资料。

酵母双杂交、免疫共沉淀研究禽传染性支气管炎病毒S1、M蛋白相互作用

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