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番茄Sly-miR167启动子的分离与调控分析

作　者: 苗青
导　师: 李正国
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: Sly-miRNA 番茄启动子 GUS 植物激素
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

番茄Sly-miR167在植株生长、座果与果实发育等过程中具有重要功能,并且在番茄基因组中存在3个基因座。MiRNA存在多基因座可能是一种重要的调控miRNA表达的方式,具有重要的生理意义。Sly-miR167在番茄中存在三个基因座分别具有不同的启动子,通过研究Sly-miR167启动子的组织特异性、时空特异性以及在外源刺激条件下的响应特性,能够为阐明miRNA多基因座现象及Sly-miR167的表达调控机理奠定基础。本研究从番茄基因组中分离了Sly-miR167三个基因座的启动子片段,将其分别与GUS基因构建融合表达载体,转化番茄,研究其表达的组织特异性和时空特异性,并利用外源激素处理,研究它们对激素的响应特性。主要研究结果如下:(1)采用PCR技术克隆了Sly-miR167三个基因座的启动子片段,利用生物信息学方法对启动子序列进行分析。结果表明,三个启动子均含有植物启动子的特征保守序列,如TATA-box,CAAT-box。另外,Sly-miR167a启动子中含有两个生长素响应元件(AuxRE),三个乙烯响应元件(ERE),三个赤霉素响应元件(GARE);Sly-miR167b启动子中含有两个ERE,一个TGA-element (AuxRE);Sly-miR167c启动子片段含有四个GARE。(2)将扩增的启动子片段分别构建到植物表达载体pMDC162中,与GUS基因融合,然后分别转入根癌农杆菌菌株GV3101中。(3)通过农杆菌介导的方法转化番茄,在潮霉素(20 mg/L)筛选压力下获得抗性植株。经GUS染色鉴定,Sly-miR167启动子-GUS融合基因已经整合到番茄基因组中,成功获得了阳性转基因番茄植株。(4) GUS染色结果表明,在转基因幼苗中,Sly-miR167a和Sly-miR167b启动子能驱动GUS基因在根、茎和叶中表达,且叶中表达最强,茎中次之,根中最弱。Sly-miR167c启动子转基因植株中,GUS基因仅在叶和茎中表达,根中未检测到GUS活性。(5)对转基因植株不同时期的花和果实进行GUS染色,结果表明,三个启动子均能驱动GUS基因在花各个部位表达,但是不同时期存在时空特异性:Sly-miR167a启动子-GUS在开花前2 d和开花当天表达强烈,花后4 d表达变弱并且花瓣中已经检测不到;Sly-miR167b和Sly-miR167c启动子转基因植株中,GUS基因在开花前两天表达强烈,开花当天和花后4 d逐渐减弱。在果实发育的不同阶段,三个启动子也表现出时空特异性:Sly-miR167a和Sly-miR167b启动子在幼果期,绿熟期和破色期表达强烈,成熟期表达减弱;Sly-miR167c启动子在幼果期和绿熟期表达强烈,破色期和成熟期表达较弱。(6)对转基因植株分别进行外源生长素(NAA),赤霉素(GA)和乙烯利处理,结果表明,Sly-miR167a启动子转基因植株经过处理后,GUS基因表达均上调;Sly-miR167b启动子转化株经NAA和GA处理后GUS基因的表达均有显著的上调;Sly-miR167c启动子转基因植株经GA和乙烯利处理后,GUS基因表达显著上调。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-10
缩略词表  10-11
1 绪论  11-18
  1.1 MicroRNA 的研究进展  11-13
    1.1.1 MicroRNA 的形成及作用机制  11
    1.1.2 MicroRNA 对植物的调控作用  11-12
    1.1.3 MicroRNA 参与调节植物对生长素的反应  12-13
  1.2 启动子的研究进展以及研究意义  13-15
    1.2.1 启动子概述  13-14
    1.2.2 启动子的研究方法  14
    1.2.3 启动子的研究意义  14-15
  1.3 研究目的和意义  15-16
  1.4 研究内容和技术路线  16-18
    1.4.1 研究内容  16-17
    1.4.2 技术路线  17-18
2 番茄 Sly-miR167 启动子的分离及表达载体构建  18-33
  2.1 材料与仪器  18-19
    2.1.1 菌株和质粒  18
    2.1.2 植物材料  18
    2.1.3 酶与化学试剂  18
    2.1.4 引物  18
    2.1.5 常用抗生素的配制  18
    2.1.6 培养基及缓冲液配制  18-19
    2.1.7 主要仪器  19
  2.2 实验方法  19-26
    2.2.1 番茄基因组DNA 的提取  19-20
    2.2.2 启动子片段的克隆  20-21
    2.2.3 启动子片段的回收  21
    2.2.4 Sly-miR167 启动子-GUS 融合基因植物表达载体的构建  21-25
    2.2.5 Sly-miR167 启动子的序列分析  25
    2.2.6 重组质粒转化农杆菌  25-26
  2.3 结果与分析  26-33
    2.3.1 番茄Sly-miR167 启动子片段的克隆  26-29
    2.3.2 Sly-miR167 启动子的序列分析  29-31
    2.3.3 表达载体的构建  31
    2.3.4 农杆菌的转化及鉴定  31-33
3 番茄 Sly-miR167 启动子的遗传转化及转基因定性  33-46
  3.1 材料与仪器  33-35
    3.1.1 菌株和质粒  33
    3.1.2 植物材料  33
    3.1.3 主要试剂  33
    3.1.4 主要抗生素及激素的配制  33-34
    3.1.5 培养基、缓冲液及试剂的配制  34-35
    3.1.6 实验仪器  35
  3.2 实验方法  35-38
    3.2.1 番茄的遗传转化  35-36
    3.2.2 转基因植株的GUS 染色鉴定  36-37
    3.2.3 启动子表达模式分析  37
    3.2.4 外源激素处理方法  37
    3.2.5 GUS 酶活测定方法  37-38
  3.3 结果与分析  38-46
    3.3.1 转基因番茄的GUS 染色鉴定  38-39
    3.3.2 Sly-miR167 启动子在番茄组织中的表达模式  39-42
    3.3.3 生长素NAA 处理对融合基因表达的影响  42-43
    3.3.4 赤霉素处理对融合基因表达的影响  43-44
    3.3.5 乙烯利处理对融合基因表达的影响  44-46
4 讨论  46-49
  4.1 启动子片段的分离及载体构建  46
  4.2 Micro-Tom 番茄的遗传转化  46-47
  4.3 Sly-miR167 启动子在转基因番茄中的表达模式分析  47-48
  4.4 Sly-miR167 启动子对外源激素的应答  48-49
5 结论与展望  49-51
  5.1 主要结论  49-50
  5.2 后续工作展望  50-51
致谢  51-52
参考文献  52-58
附录  58

番茄Sly-miR167启动子的分离与调控分析

内容摘要

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