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丁香假单胞菌番茄致病变种和烟草致病变种egfp标记突变体的构建
作 者: 李江利
导 师: 蒋士君
学 校: 河南农业大学
专 业: 植物病理学
关键词: 丁香假单胞菌番茄致病变种 丁香假单胞菌烟草致病变种 hrpA hrpZ egfp标记突变体
分类号: S436.412
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
植物病原细菌的三型分泌系统(TTSS)是丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)侵染过程中重要的蛋白分泌系统。TTSS的编码、蛋白分泌等受到hrp基因的调节。研究hrp基因在病菌侵染过程中的表达情况有助于进一步探索hrp基因的功能,揭示植物病原细菌的分子致病机制,而egfp标记突变体的构建是开展寄主-病原物的互作研究的重要策略。本试验拟以增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)作为报告基因,以植物丁香假单胞菌烟草致病变种和番茄致病变种为材料,以其hrpA基因和hrpZ基因为靶标,通过体外重组和双亲结合技术,分别构建靶标基因与egfp融合表达的突变体,以及靶标基因缺失的egfp标记突变体,为今后研究丁香假单胞菌-植物的互作提供有用的材料工具。主要试验结果为:(1)以丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株和烟草致病变种4号菌株的基因组DNA为模板,扩增出了hrpA、hrpZ基因及其上下游片段;以pEGFP-C1为模板扩增出了egfp ORF全长。将相关的DNA片段进行体外重组后,得到了4个与预期大小一致的目的大片段CDE3、CTE1、CTE3、CTE4,它们分别为hrpZPto::egfp、hrpAPsta::egfp、hrpZPsta::egfp融合型片段和△hrpZPsta::egfp缺失型片段,为下一步构建融合型、缺失型突变体的构建奠定了基础。(2)试验将获得的目的大片段CDE3、CTE1、CTE3、CTE4分别连接至克隆载体pMD19-T,提取阳性克隆质粒pMD19-CDE3、pMD19-CTE1、pMD19-CTE3、pMD19-CTE4的DNA与自杀型质粒pKSM1的DNA同时进行BamHI和XbaI双酶切,切胶回收的酶切片段进行连接,得到了适于进行双亲接合所用的自杀型重组质粒pKSM-CDE3、pKSM-CTE1、pKSM-CTE3、pKSM-CTE4。(3)将含有质粒pKSM-CDE3的大肠杆菌S17-1与番茄致病变种DC3000野生型菌株进行双亲接合后获得了hrpZPto::egfp融合型突变体;将含有质粒pKSM-CTE1、pKSM-CTE3、pKSM-CTE4的大肠杆菌S17-1分别与烟草致病变种4号菌野生型菌株进行双亲结合获得了hrpAPsta::egfp、hrpZPsta::egfp融合型突变体和△hrpZPsta::egfp缺失型突变体。将获得的4个突变体菌株划线于KB培养基(30μg/ml Nalr)上,在紫外灯下观察发现hrpAPsta::egfp融合型突变体有明显的绿色荧光,而hrpZPto::egfp、hrpAPsta::egfp融合型突变体及△hrpZPsta::egfp缺失型突变体则无绿色荧光。(4)与野生型菌株相比,以上构建的4个egfp标记突变体人工接种烟草后,pv. tomato DC3000的hrpZPto::egfp融合型突变体的过敏性诱导能力明显降低;hrpAPsta::egfp、hrpZPsta::egfp融合型突变体及△hrpZPsta::egfp缺失型突变体的致病性也明显降低。
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全文目录
致谢 4-7摘要 7-81. 文献综述 8-23 1.1 植物丁香假单胞菌所致病害在我国的发生概况 8-9 1.2 植物病原细菌的致病机制 9-14 1.2.1 植物病原细菌的生化致病因子 9-11 1.2.1.1 植物病原细菌的胞壁降解酶 9-10 1.2.1.2 植物病原细菌毒素 10 1.2.1.3 植物病原细菌的激素 10-11 1.2.1.4 植物病原细菌的胞外多糖(EPS) 11 1.2.2 植物病原细菌的分子致病性 11-14 1.2.2.1 植物病原细菌的致病性基因 11-12 1.2.2.2 植物病原细菌的TTSS 12-13 1.2.2.3 植物病原细菌的分子致病性的调控机制 13-14 1.3 植物病原细菌hrp 基因的研究现状 14-18 1.3.1 Hrp 基因的分布与结构 14 1.3.2 Hrp 基因的表达与功能 14-18 1.3.2.1 Hrp 基因的表达和调控 14-15 1.3.2.2 Hrp 基因与无毒基因的表达 15-16 1.3.2.3 Hrp 基因与harpin 蛋白的编码 16-17 1.3.2.4 Hrp 基因与效应蛋白的分泌表达 17-18 1.4 突变体策略在基因功能研究中的应用 18-23 1.4.1 突变体在病原-寄主互作研究中的重要性 18-21 1.4.2.1 物理诱变 19 1.4.2.2 化学诱变 19 1.4.2.3 转座子诱变 19-20 1.4.2.4 T-DNA 插入突变 20 1.4.2.5 同源重组 20-21 1.4.3 报告基因在突变体构建中的应用与egfp 标记策略 21-232. 引言 23-243. 材料与方法 24-35 3.1 供试材料 24-25 3.1.1 供试菌株及质粒 24 3.1.2 主要试剂及工具酶 24 3.1.3 供试试剂盒 24 3.1.4 缓冲溶液 24-25 3.2 试验方法 25-35 3.2.1 丁香假单胞菌番茄致病变种与烟草致病变种靶标基因片段的扩增 25-31 3.2.1.1 引物设计 25-26 3.2.1.2 丁香假单胞菌番茄致病变种与烟草致病变种hrpA 与hrpZ 上下游片段及egfp 基因的PCR 扩增 26-28 3.2.1.3 目的片段第一次重组PCR 扩增 28-29 3.2.1.4 目的片段第二次重组PCR 扩增 29-30 3.2.1.5 重组目的大片段的T/A 克隆 30 3.2.1.6 E.coli Jm109 化学感受态的制备(CaCl_2 法) 30 3.2.1.7 重组质粒转化Jm109 30-31 3.2.1.8 重组质粒DNA 的提取及鉴定 31 3.2.2 丁香假单胞菌番茄致病变种与烟草致病变种egfp 标记突变体的构建及筛选 31-35 3.2.2.1 丁香假单胞菌番茄致病变种与烟草致病变种egfp 标记突变体的构建策略 31-32 3.2.2.2 丁香假单胞菌番茄致病变种及烟草致病变种的双亲接合试验及突变体的筛选鉴定 32-34 3.2.2.3 egfp 标记突变体致病性及过敏性测定 34-354. 结果与分析 35-45 4.1 丁香假单胞菌番茄致病变种与烟草致病变种靶标基因片段的重组 35-39 4.1.1 hrpA 基因和hrpZ 基因靶标目的片段的扩增及纯化 35-36 4.1.2 目的片段第一次重组PCR 扩增及纯化 36-37 4.1.3 目的片段第二次重组PCR 扩增及纯化 37-39 4.2 目的片段的T/A 克隆及验证 39-40 4.3 目的片段与自杀型质粒pKSM1 的酶切连接及验证 40-42 4.4 丁香假单胞菌番茄致病变种及烟草致病变种突变体的鉴定 42-455. 结论与讨论 45-48 5.1 结论 45 5.2 讨论 45-48参考文献 48-54ABSTRACT 54-55
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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 蔬菜病虫害 > 茄果类病虫害 > 番茄病虫害
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