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转FSH基因克隆猪的制备

作　者: 廖荣荣
导　师: 任军；黄路生
学　校: 江西农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪转基因 FSHα 高繁殖力
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

我国是世界第一生猪生产和猪肉消费大国,养猪业在我国国民经济中占有重要地位。繁殖性状是养猪业中重要的经济性状之一,包括产仔数、产活仔数、受胎率等。繁殖性状为复杂多基因控制的低遗传力性状,主要受品种遗传、环境、营养、年龄、管理和利用等影响。衡量繁殖性状高低的一个重要指标是产仔数,该性状主要受排卵数、受胎率、胚胎成活率和环境效应等多种因素的影响,常规选育的进展缓慢。自1980年Gurdon首次获得转基因小鼠起,育种专家们陆续将转基因技术应用于畜禽育种,期望迅速提高包括繁殖性状在内的各种生产性能。已有研究表明,促卵泡激素基因(FSH)是影响猪产仔数的主效基因,本实验拟采用体细胞克隆转基因技术生产转FSH基因克隆猪以提高种猪产仔性能。本研究利用FSHα基因的BAC载体,采用缺陷型λ原噬菌体介导的同源重组对二花脸猪FSHα-BAC进行了修饰,插入了能产生抗G418蛋白的Neo基因,获得了FSHα-loxp-Neo-loxp-BAC转基因载体,随后与经相同方法得到的FSHβ-loxp-Neo-loxp-BAC转基因载体混合转染至大白猪胎儿成纤维细胞,经G418筛选后获得稳定表达抗G418蛋白的转基因阳性细胞系,通过显微注射法将体细胞注射到去核猪卵母细胞中,电击融合同时激活转基因胚胎并转入化学辅助激活滴中处理3-4h,待胚胎长至2-4细胞后经手术法移植入受体母猪输卵管深部,等待转基因猪诞生。采用BAC介导的转基因克服了外源基因整合拷贝数过高、基因元件不完整等问题；采用Spindle-view纺锤体示核法系统进行显微去核操作,获得了很高的去核率。本研究为最终制备成具有高繁殖潜力的转FSH基因克隆猪奠定了重要的前期工作基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第一章文献综述  8-15
  1 前言  8-9
  2 动物克隆技术  9-10
  3 动物转基因技术  10-11
  4 转基因克隆技术在家畜育种中的研究与应用  11-12
  5 BAC介导的转基因方法  12-13
  6 高繁殖力基因FSH简介  13-14
  7 本研究的目的和意义  14-15
第二章研究正文  15-41
  1 前言  15
  2 材料与方法  15-29
    2.1 实验材料  15-20
      2.1.1 质粒及菌株  15
      2.1.2 大白猪胎儿  15-16
      2.1.3 猪卵巢  16
      2.1.4 主要试剂及其配制和主要试剂盒  16-17
      2.1.5 显微操作针的制备  17-19
      2.1.6 主要仪器及耗材  19
      2.1.7 主要引物信息  19-20
    2.2 实验方法  20-29
      2.2.1 BAC-DNA的提取  21
      2.2.2 FSH α-loxp-Neo-loxp-BAC的构建  21-23
      2.2.3 胎儿成纤维细胞系建立  23-24
      2.2.4 成纤维细胞系的性别鉴定  24
      2.2.5 用FSH α-loxp-neo-loxp-BAC DNA转染猪胎儿成纤维细胞  24
      2.2.6 转基因阳性细胞的筛选  24
      2.2.7 阳性细胞的检测  24-25
      2.2.8 转基因克隆胚胎的获得  25-28
      2.2.9 胚胎的移植  28-29
  3 实验结果  29-35
    3.1 FSH α-BAC基因信息的确定  29-30
    3.2 FSHα-BAC-SW102菌株的获得  30-31
    3.3 含有-loxp-Neo-loxp-基因打靶载体的获得  31
    3.4 FSH α-loxp-neo-loxp-BAC SW102菌株的获得  31-32
    3.5 用于转基因的FSH α-loxp-neo-loxp-BAC载体的提取与鉴定  32-33
    3.6 待转染细胞的性别鉴定  33-34
    3.7 转FSH α-loxp-Neo-loxp-BAC细胞系的建立  34
    3.8 孤雌胚的体外发育情况  34-35
    3.9 移植妊娠受孕情况  35
  4 分析与讨论  35-41
    4.1 关于转FSHα基因生产高繁殖力克隆猪  35-36
    4.2 BAC载体混合转染  36
    4.3 运用Spindle view纺锤体示核法系统去核操作的高成功率  36-37
    4.4 细胞性别鉴定的选择  37
    4.5 关于载体的构建  37-38
    4.6 插入的FSH α基因完整性的问题  38
    4.7 激活/融合参数对孤雌胚的影响  38-39
    4.8 关于孤雌胚胎的培养  39-40
    4.9 转基因克隆猪的鉴别  40-41
小结  41-42
参考文献  42-46
致谢  46-47

转FSH基因克隆猪的制备

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