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基因棉粕检测及其转基因成分在饲料加工工艺中的降解规律研究

作　者: 管庆丰
导　师: 尹清强；王建华
学　校: 河南农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 转基因棉粕 转基因成分检测 饲料加工 降解
分类号: S816
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


越来越多的转基因产品进入饲料领域,日益引起大家对饲料安全的关注。本实验从饲料原料转基因棉粕入手,研究转基因棉粕中转基因成分的提取方法,定性及定量检测转基因棉粕中的转基因成分,并研究干热和湿热处理及湿热膨化等工艺对转基因棉粕中转基因成分的降解规律,为转基因成分的生物安全评价提供科学依据。分别采用CTAB法、SDS法等方法提取棉粕(籽)基因,探讨适用于转基因棉粕(籽)基因的提取方法,发现基于SDS的方法更适合棉粕(籽)基因的提取。对此方法进行改进,开发基于离心柱型的试剂盒。实验表明,该试剂盒提取时间短,提取基因纯度高,完全可以满足下游实验。采用常规PCR、双重PCR及环介导等温扩增(LAMP)技术对转基因棉粕进行定性检测。扩增片段条带清晰,特异性高。常规PCR检测极限为100拷贝。对于Cry1Ab/c基因及Sad1基因来说,退火温度在55.5℃-58.3℃范围内都能扩增出目的基因片段,扩增效果没有明显差异。在一个反应体系里同时加入外源基因和内源基因的引物,进行双重PCR,并对退火温度进行摸索,发现在55.5℃-58.3℃范围内,都能检测到Cry1Ab/c基因及Sad1基因。59.1℃以后,Cry1Ab/c基因检测不到。对LAMP反应程序进行优化,其检测灵敏度为10拷贝,是常规PCR反应的10倍。通过融合PCR方法成功构建了转基因棉花检测的质粒标准品,建立以基因特异性为基础、以拷贝数比为计算方法的转基因棉粕检测方法,并以此对河南等省的转基因棉粕进行定量检测。该方法被证明为一种准确的检测方法,可以用来对转基因棉花及其副产品进行定量检测。从各地棉粕转基因情况来看,在目前检测的几个地区都含有Bt基因,除新疆塔城区及驻马店地区外,其余几地转基因Bt棉粕外源基因与内源基因拷贝数比均大于50%。本文对转基因棉粕进行干热处理和湿热处理,及湿热膨化处理,针对外源基因和内源基因分别设计5对特异性的引物,分析三种处理方式对转基因成分不同大小片段的降解规律。结果表明,随着温度升高,转基因大片段都逐渐降解,但降解的幅度不同。同等条件下,湿热处理对转基因棉粕的降解作用大于干热处理。105℃不同时间干热及湿热处理后,各片段降解差异不大。在湿热膨化中,温度越高,大片段降解越明显。不同的水分比例对各片段的降解差异不大。对小片段定量分析结果表明,不同条件干热处理后转基因棉粕外源基因与内源基因的拷贝数比没有明显的变化规律。105℃不同时间湿热处理后,外源基因与内源基因的拷贝数比没有明显的变化规律。温度升高时,外源基因与内源基因的拷贝数比逐渐降低。不同比例水分湿热膨化后,外源基因与内源基因的拷贝数比没有明显的变化规律。膨化温度升高后,外源基因与内源基因的拷贝数比逐渐降低。

全文目录


致谢  4-8摘要  8-10Abstract  10-12引言  12-13第一章 文献综述  13-21  1.1 转基因作物的生产现状  13-14  1.2 转基因饲料的安全性问题  14  1.3 转基因饲料的检测方法  14-19    1.3.1 基于蛋白质的检测方法  14-15    1.3.2 基于核酸的检测方法  15-19  1.4 加工过程对转基因饲料DNA 的降解研究  19  1.5 本研究的目的和意义  19-21第二章 转基因棉粕(籽)中转基因成分定性检测  21-32  2.1 实验材料与试剂  21-22    2.1.1 材料  21    2.1.2 试剂  21    2.1.3 主要仪器  21-22  2.2 实验方法  22-25    2.2.1 棉粕及棉籽DNA 提取方法研究  22-23    2.2.2 转基因棉粕核酸定性检测  23-25  2.3 结果与分析  25-30    2.3.1 DNA 提取  25-27    2.3.2 定性检测  27-30  2.4 讨论  30-32第三章 含Bt 棉粕外源基因与内源基因荧光定量检测  32-43  3.1 实验材料与试剂  32    3.1.1 材料  32    3.1.2 试剂  32  3.2 实验方法  32-35    3.2.1 质粒标准品构建  32-34    3.2.2 棉粕基因组提取  34    3.2.3 定量检测转基因棉粕  34    3.2.4 荧光定量 PCR 反应  34-35  3.3 结果与分析  35-41    3.3.1 Cry1Ab/c-Sad1 基因融合  35    3.3.2 重组质粒筛选及鉴定  35-37    3.3.3 定量引物特异性检测  37-38    3.3.4 荧光定量检测标准曲线  38-39    3.3.5 批次内及批次间可重复性检测  39-41    3.3.6 各地转基因棉粕含量及比较  41  3.4 讨论  41-43第四章 转基因棉粕在饲料加工工艺中的变化规律  43-62  4.1 实验材料及仪器  43    4.1.1 实验材料  43    4.1.2 实验试剂  43    4.1.3 主要设备仪器  43  4.2 实验方法  43-46    4.2.1 干热及湿热处理  43-44    4.2.2 湿热膨化处理  44    4.2.3 引物设计  44-45    4.2.4 棉粕DNA 提取棉粕采取优化SDS 法提取  45    4.2.5 荧光定量PCR 分析  45-46  4.3 结果与分析  46-60    4.3.1 干热处理不同片段PCR 扩增  46-49    4.3.2 湿热处理不同片段PCR 扩增  49-52    4.3.3 湿热膨化不同片段PCR 扩增  52-55    4.3.4 干热处理定量分析结果  55-56    4.3.5 湿热处理定量分析结果  56-58    4.3.6 湿热膨化定量分析结果  58-60  4.4 讨论  60-62参考文献  62-64

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 普通畜牧学 > 饲料
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