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转BMPR-IB基因克隆猪的制备

作　者: 何晓芳
导　师: 任军；黄路生
学　校: 江西农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪 转基因 BMPB-1B 体细胞克隆
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 63次
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内容摘要


在养猪生产中,繁殖力是反映猪场生产水平和经济效应的重要指标,因此,培育高繁殖力的种猪具有重要的意义。然而,繁殖力是受复杂多基因控制的复杂低遗传力性状,且受环境、饲养管理等众多因素影响,遗传改良进程极其缓慢。自1982年转基因“硕鼠”诞生以来,人类便开始将转基因技术应用于动物品种改良领域。随着体细胞克隆技术的出现和逐渐成熟,国际上先后培育出了具有“抗病”、“环保”、“高生长速度”等特性的转基因克隆猪。BMPR-IB基因是影响Booroola Merino羊多胎性能的主效基因,且已证明该基因对牛产仔数有影响。BMPR-IB基因定位于猪8号染色体上,其全长cDNA序列为3559bp,开放阅读框为1509 bp,编码502个氨基酸。本研究首先利用猪脑、卵巢组织总cDNA库,采用RT-PCR方法扩增,获得BMPR-IB的1607 bp DNA序列,定点突变获得高繁殖力等位基因,然后将此片段重组到pEF-GFP载体中,插入Neo基因后,得到重组真核表达载体pEF-BMPRIB-Neo。随后通过脂质体介导法转染至大白猪胎儿成纤维细胞内,经G418筛选后获得稳定表达的阳性细胞系,利用显微注射法将体细胞注射入猪卵母细胞,电击融合同时激活转基因胚胎,转入含CB和6-DMAP的化学辅助激活滴中处理3-4 h,待克隆胚生长至2-4细胞期后,手术法将胚胎移植入受体母猪输卵管深部,等待转基因猪诞生。本研究通过转基因克隆技术以期获得高繁殖潜力的转基因克隆猪,为高繁殖力转基因猪育种提供新的科研材料,促进我国养猪业的发展。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
第一章 文献综述  8-14
  前言  8-9
  1 转基因技术与转基因动物  9
  2 转基因克隆技术  9-11
  3 转基因家畜的研究进展  11
  4 高繁殖力目标基因BMPR-IB  11-13
  5 本研究的目的与意义  13-14
第二章 研究正文  14-42
  1 引言  14
  2 实验材料  14-26
    2.1 材料  14-18
      2.1.1 实验动物  14
      2.1.2 实验常用试剂、质粒及菌株  14
      2.1.3 主要试剂的配制  14-16
      2.1.4 主要仪器及耗材  16
      2.1.5 显微操作针的制备  16-18
    2.2 实验方法  18-26
      2.2.1 载体构建及表达  18-22
      2.2.2 胎儿成纤维细胞系建立  22
      2.2.3 阳性细胞株的获取  22-24
      2.2.4 转基因克隆胚胎的获得  24
      2.2.5 体细胞核移植  24-25
      2.2.6 转基因胚胎的移植  25-26
      2.2.7 妊娠检测  26
  3 实验结果  26-33
    3.1 BMPR-IB基因CDS片段的获得  26-27
    3.2 BMPR-IB基因定点突变  27
    3.3 BMPR-IB基因插入  27
    3.4 插入Neo基因后构建载体pEF-BMPR-IB-Neo  27-28
    3.5 重组载体pEF-BMPR-IB-Neo完整性检测  28
    3.6 质粒线性化结果  28
    3.7 质粒细胞水平检测分析  28-29
    3.8 胎儿细胞系建立  29
    3.9 脂质体转染后的细胞汇合度及用G418筛选细胞状态  29-30
    3.10 转基因阳性细胞克隆挑取及鉴定  30-31
    3.11 阳性细胞PCR检测鉴定结果  31
    3.12 RT-PCR检测阳性细胞及基因突变点  31-32
    3.13 卵母细胞成熟判定  32
    3.14 卵母细胞去核的效果  32
    3.15 囊胚计数及发育状况  32-33
  4 分析与讨论  33-42
    4.1 猪BMPR-IB基因的研究进展  33
    4.2 重组载体构建及表达  33-34
    4.3 阳性细胞系建立和应用  34-35
    4.4 卵母细胞成熟条件和去核的预处理  35-36
    4.5 卵母细胞的去核及注核  36-38
    4.6 转基因胚胎的融合与激活  38-39
    4.7 重构胚的体外培养  39
    4.8 胚胎移植  39-40
    4.9 克隆猪出生率和转基因猪的鉴定  40-42
小结  42-43
参考文献  43-50
致谢  50-51

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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