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副粘病毒Tianjin株主要蛋白在真核细胞中的表达及其反向遗传学的初步研究

作　者: 王文秀
导　师: 李梅；石立莹
学　校: 天津医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 副粘病毒Tianjin株 HN蛋白 NP蛋白 L蛋白稳定表达 Western blot 红细胞吸附
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

副粘病毒Tianjin株是仙台病毒的一个新基因型,仙台病毒为啮齿类动物(鼠类)致死性病原体,在鼠群中可引起致死性肺炎,死亡率高。1999年天津医科大学实验动物中心饲养的普通棉耳狨猴群体中爆发急性呼吸道传染病,多种抗生素治疗无效,多数于发病后5～10天内死亡,尸体解剖显示肺组织灶性坏死。然而在普通棉耳狨猴呼吸道疾病流行期间,饲养在同一实验中心的各种实验用鼠无一例发病,而该毒株却导致了普通棉耳狨猴群体的严重下呼吸道感染,表明此病毒在致病性和宿主亲嗜性上具有某些新的特点,即对啮齿类动物低致病性,而对普通棉耳狨猴高致病性。进一步采用双抗体夹心ELISA法,检测严重下呼吸道感染儿童支气管肺泡灌洗液(BALF)中的病毒抗原,阳性率为1.92%,表明副粘病毒Tianjin株还可能是人类,特别是儿童下呼吸道感染的重要病原体。近年来,人类新发传染性疾病的病毒病原体(Emerging pathogens)几乎都是来源于动物,这些病毒跨越种属感染人类,对人类的健康构成了巨大威胁,受到全社会的高度关注。阐明病毒的高致病性和跨种传播机制,对于防控这类传染病的发生和流行意义重大。在自然条件下,副粘病毒的宿主特异性限制了种间的传播。宿主特异性受多因素的影响,病毒表面的糖蛋白起识别和吸附细胞受体的作用,是决定宿主特异性的主要因素。因此,我们对副粘病毒Tianjin株的糖蛋白—HN蛋白进行了真核表达,并对该病毒进行了反向遗传学的初步研究,为进一步研究高致病性和跨种属传播机制奠定基础。本实验分两部分。在第一部分工作中,构建了副粘病毒Tianjin株包膜糖蛋白HN及其分段基因HN1、HN2和HN3的真核表达载体pEGFP-C2-HN、pEGFP-C2-HN1、pEGFP-C2-HN2和pEGFP-C2-HN3,将其转染HEK293细胞。Western blot检测蛋白的表达,用原位ELISA法和红细胞吸附实验,检测各表达蛋白的抗原性和生物活性。结果在荧光显微镜下,转染了重组质粒pEGFP-C2-HN、pEGFP-C2-HN1、pEGFP-C2-HN2和pEGFP-C2-HN3的细胞呈现绿色荧光。Western blot方法可检测到HN、HN1、HN2和HN3蛋白的表达。原位ELISA法测得重组HN蛋白、HN1蛋白和HN2蛋白有抗原性,而重组HN3蛋白抗原性较弱。红细胞吸附实验,显示出HN蛋白和HN3蛋白具有吸附红细胞的能力,HN1、HN2蛋白未见明显的红细胞吸附现象。在第二部分工作中,用9-11日龄的鸡胚将副粘病毒Tianjin株进行传代,提燃ε吣蚰乙褐胁《綬NA,RT-PCR扩增出NP和P基因,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-NP和pcDNA3.1(+)-P。用融合PCR法扩增出L基因。将质粒pcDNA3.1(+)-NP和pcDNA3.1(+)-P转染HEK293细胞。应用间接免疫荧光法和Western blot法检测到NP蛋白的稳定表达。为进一步研究NP蛋白的功能和利用反向遗传学技术重组副粘病毒Tianjin株,研究其跨种传播和高致病性奠定了基础。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-9
符号说明  9-11
前言  11-15
  研究现状、成果  11-13
  研究目的、方法  13-15
一、副粘病毒Tianjin株 HN蛋白及其分段蛋白的表达、功能分析  15-38
  1.1 材料和方法  15-25
  1.2 结果  25-33
  1.3 讨论  33-37
  1.4 小结  37-38
二、副粘病毒Tianjin株反向遗传学初步研究  38-53
  2.1 材料和方法  38-44
  2.2 结果  44-48
  2.3 讨论  48-52
  2.4 小结  52-53
结论  53-54
参考文献  54-60
发表论文  60
参加科研情况说明  60-61
附录  61-66
综述  66-80
  RNA病毒反向遗传学技术的研究和应用  66-76
  综述参考文献  76-80
致谢  80

副粘病毒Tianjin株主要蛋白在真核细胞中的表达及其反向遗传学的初步研究

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