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长角血蜱卵黄蛋白单克隆抗体的制备和卵黄发生的研究

作　者: 李晓明
导　师: 刘敬泽；闫静辉
学　校: 河北师范大学
专　业: 动物学
关键词: 长角血蜱 卵黄发生 卵黄蛋白 单克隆抗体 脂肪体 血淋巴 卵巢 卵黄原蛋白
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


蜱类是专性吸血的外寄生动物,传播多种人、畜疾病且具极强的繁殖力,对人类健康和畜牧业造成极大危害。蜱类生殖生理学是国际上研究的热点领域,其中卵黄发生及其调控是该领域的核心内容。本研究以广泛分布于我国的长角血蜱Haemaphysalis,longicornis Neumann为研究对象,运用生物化学、免疫学、气象色谱/质谱等现代生物学及其交差学科的研究方法,首次制备出长角血蜱卵黄蛋白（vitellin,Vn）的单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）,并对纯化的抗体做了一系列鉴定;在此基础上,采用双抗体夹心ELISA法测定长角血蜱各时期中心脂肪体,外周脂肪体,血淋巴和卵巢中卵黄原蛋白（vitellogenin,Vg）或Vn的含量;纯化出Vg,并对其理化性质进行了研究。上述研究对于深入阐明蜱类卵黄发生及其调控机理,揭示蜱类尘殖生物学规律、适应对策和生理调节机制具有重要的科学意义。主要结果如下:1、用长角血蜱Vn免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经3次克隆化筛选,获得6株能稳定分泌抗Vn的单克隆抗体,即1B5、2A7、2B8、2F2、3A1和3G1。2、采用Sigma公司的mouse monoclonal antibody isotyping reagents测定抗体亚型,1B5,2B8和2F2亚型为IgGA;2A7亚型为IgG1;3A1和3G1亚型为IgG2a。3、经夹心ELISA和间接ELISA检测,6株单克隆抗体均具有高度特异性,效价均在1:105以上。4、选取效价和特异性最好的1株抗体1B5进行SDS-PAGE分析和亲和力测定,测得1B5重链和轻链的分子量分别为58 kD和21 kD,亲和常数为2.8993×10-6,具有很强亲和力。5、Western免疫印迹分析,发现6株单抗均与Vn的8个亚基发生免疫反应。6、采用双抗体夹心ELISA法测定长角血蜱各时期中心脂肪体,外周脂肪体,血淋巴和卵巢中Vg或Vn的含量。结果表明,中心脂肪体和外周脂肪体均在饱血后2天产生Vg,血淋巴在饱血后2天也含有Vg,但含量相对较少,卵巢中直到饱血后4天才出现Vn,证明长角血蜱的卵黄发生是脂肪体合成Vg,并释放到血淋巴,由发育中的卵母细胞选择性摄取、加工成Vn,作为胚胎发育的营养来源。7、长角血蜱Vg只有一种,是一种糖脂复合蛋白,相对分子质量为487 kD,由7个亚基组成,亚基相对分子质量分别为165 kD、134 kD、112 kD、80 kD、78 kD、71 kD和65 kD。8、长角血蜱Vg经双向电泳分析表明,Vg内可溶性蛋白约由16个蛋白点组成,P4和P6为单一的蛋白点,等电点集中在5～8之间。9、应用GC/MS技术鉴定Vg脂类,结果表明,Vg脂类的主要脂肪酸成分为十六烷酸和十八烷酸。

全文目录


缩略语  7-9
摘要  9-11
Abstract  11-13
第一章 蜱类的卵黄发生和单克隆抗体技术在蜱类研究中的应用  13-27
  1 蜱类的卵黄发生  13-17
    1.1 卵黄原蛋白和卵黄蛋白  13-15
    1.2 卵黄原蛋白的合成  15-16
    1.3 卵黄原蛋白的摄取  16-17
  2 单克隆抗体技术及其在蜱类研究中的应用  17-27
    2.1 抗体的基本结构  18-19
    2.2 杂交瘤技术的基本原理  19-21
    2.3 杂交瘤技术的基本流程  21-22
    2.4 单克隆抗体和多克隆抗体的比较  22-23
    2.5 单克隆抗体在蜱类生物学研究中的应用  23-27
第二章 长角血蜱卵黄蛋白单克隆抗体的制备及其鉴定  27-47
  1 引言  27
  2 材料与方法  27-37
    2.1 卵黄蛋白单克隆抗体的制备  27-32
    2.2 卵黄蛋白多克隆抗体的制备  32-33
    2.3 单克隆抗体亚型鉴定  33
    2.4 单克隆抗体效价及IgG浓度测定  33
    2.5 单克隆抗体的SDS-PAGE分析  33
    2.6 单克隆抗体特异性鉴定  33-34
    2.7 单克隆抗体的亲和力测定  34
    2.8 单克隆抗体的Western blot分析  34-35
    2.9 主要溶液配制  35-37
  3 结果  37-45
    3.1 卵黄蛋白单克隆抗体的制备  37-38
    3.2 卵黄蛋白多克隆抗体的效价测定  38-39
    3.3 单克隆抗体亚型鉴定  39
    3.4 单克隆抗体的效价和IgG浓度测定  39-40
    3.5 单克隆抗体特异性鉴定  40-41
    3.6 单克隆抗体的SDS-PAGE分析  41-42
    3.7 单克隆抗体的亲和力测定  42-44
    3.8 单克隆抗体的Western blot分析  44-45
  4 讨论  45-47
第三章 长角血蜱卵黄原蛋白的合成组织定位及动态  47-57
  1 引言  47-48
  2 材料与方法  48-49
    2.1 卵黄蛋白标准曲线的建立  48
    2.2 检测各组织中Vg/Vn的含量  48-49
  3 结果  49-55
    3.1 卵黄蛋白标准曲线的建立  49-50
    3.2 不同发育期中心脂肪体中卵黄原蛋白含量的动态变化  50-51
    3.3 不同发育期外周脂肪体中卵黄原蛋白含量的动态变化  51-52
    3.4 不同发育期血淋巴中卵黄原蛋白含量的动态变化  52-53
    3.5 不同发育期卵巢中卵黄蛋白含量的动态变化  53-55
  4 讨论  55-57
第四章 长角血蜱卵黄原蛋白的纯化及其性质  57-69
  1 引言  57
  2 材料与方法  57-62
    2.1 长角血蜱卵黄原蛋白的纯化  57-59
    2.2 卵黄原蛋白电泳分析  59
    2.3 卵黄原蛋白的脂蛋白染色  59
    2.4 卵黄原蛋白的糖蛋白染色  59
    2.5 卵黄原蛋白的双向电泳  59-61
    2.6 GC/MS分析卵黄原蛋白脂类成分  61-62
  3 结果  62-68
    3.1 长角血蜱卵黄原蛋白的纯化  62
    3.2 卵黄原蛋白相对分子量  62-63
    3.3 卵黄原蛋白的亚基组成  63-64
    3.4 卵黄原蛋白的糖脂蛋白染色  64
    3.5 卵黄原蛋白双向电泳  64-65
    3.6 卵黄原蛋白脂类的脂肪酸分析  65-68
  4 讨论  68-69
参考文献  69-79
附录  79-83
致谢  83-85
个人简历  85

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜寄生虫学
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