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长角血蜱半饱血雄蜱抑制性消减cDNA文库的构建及MIF基因的原核表达

作　者: 刘建刚
导　师: 刘光远
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医
关键词: 长角血蜱半饱血雄蜱 抑制性消减杂交(SSH) cDNA文库 巨噬细胞游走抑制因子 原核表达
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 95次
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内容摘要


长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是我国流行最广泛和最重要的蜱种之一,主要叮咬牛、羊及多种脊椎动物,是病毒、立克次氏体、螺旋体、细菌、原虫、支原体和衣原体等多种病原重要的传播媒介。长角血蜱及其传播的疾病对我国畜牧业发展造成了重大经济损失。长期以来,对蜱的控制方法主要以化学药物为主,但随着蜱耐药性的产生以及环境污染和药物残留等严重公共卫生问题的出现,迫使人们寻求防治的新途径。迄今为止,蜱的免疫学防治最有前途。本研究采用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了长角血蜱雄蜱消减cDNA文库,以期获得长角血蜱雄性成蜱在半饱血状态下特异表达的基因。用抑制消减杂交方法构建以pGEM-T-easy为载体的长角血蜱半饱血雄蜱全蜱cDNA文库,测序并进行生物信息学分析。初步获得了18个EST,Blastx分析显示,所得cDNA编码的功能性蛋白主要包括信号传导、组织形态形成、转录调节和糖类代谢等相关蛋白。以长角血蜱半饱血和饥饿雄蜱总RNA为模板,RT-PCR方法对文库中挑选的5个EST进行鉴定,结果显示,所有5个新EST中有三个在半饱血下差异表达。另外根据GenBank中的长角血蜱巨噬细胞游走抑制因子(macrophagemigration inhibitor factor,MIF)基因序列(序列号:AB255601.1)设计引物,以长角血蜱半饱血成蜱总RNA为模板,RT-PCR扩增出368 bp的HLMIF DNA片段。将其与pET-30a-(+)载体连接构建pET-30a-HLMIF表达载体,转化BL21(DE3)大肠杆菌,经PCR和双酶切鉴定及测序分析。IPTG诱导表达后收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析,优化表达条件后纯化融合蛋白。结果表明,获得的HLMIFDNA片段与GenBank中的HLMIF序列的同源性为99.7%。构建的pET-30a-HLMIF表达载体在大肠杆菌中表达了大小约为18.5 ku的HLMIF融合蛋白,主要以可溶性蛋白的形式存在,IPTG浓度为1.0 mmol/L、37℃诱导7h后融合蛋白的表达量最高。长角血蜱雄蜱抑制性消减杂交cDNA文库的构建和巨噬细胞游走抑制因子(HLMIF)的原核表达为长角血蜱功能基因的克隆和分子疫苗的研究奠定了基础。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章 绪论  12-18
  1.1 蜱的防治及功能分子的研究进展  12-14
    1.1.1 目的和意义  12-13
    1.1.2 国内外研究进展  13-14
  1.2 差异表达基因筛选方法的研究现状  14-16
    1.2.1 mRNA差异显示反转录PCR技术  14-15
    1.2.2 cDNA代表性差异分析  15
    1.2.3 基因表达系列分析  15
    1.2.4 抑制性消减杂交技术  15-16
  1.3 结语  16-18
第二章 长角血蜱雄蜱抑制消减文库的构建与鉴定  18-32
  2.1 材料和方法  18-22
    2.1.1 材料  18-19
    2.1.2 方法  19-22
  2.2 结果  22-27
    2.2.1 总RNA提取、mRNA纯化及检测  22-23
    2.2.2 双链cDNA的合成与酶切  23-24
    2.2.3 接头连接效率检测  24-25
    2.2.4 消减PCR结果  25
    2.2.5 消减效率检测  25-26
    2.2.6 消减cDNA文库的扩增及初步鉴定  26
    2.2.7 文库差异表达基因的生物信息学分析  26-27
    2.2.8 EST质量鉴定  27
  2.3 讨论  27-32
    2.3.1 文库构建分析  27-29
    2.3.2 差异基因分析  29-32
第三章 巨噬细胞游走抑制因子(MIF)的克隆与原核表达  32-43
  3.1 材料与方法  32-37
    3.1.1 试验材料  32-33
    3.1.2 试验方法  33-37
  3.2 结果  37-41
    3.2.1 目的基因的RT-PCR扩增  37
    3.2.2 重组表达质粒pET-30a-HLMIF的鉴定  37-40
    3.2.3 重组质粒的测序结果  40
    3.2.4 表达产物的SDS-PAGE分析  40-41
  3.3 讨论  41-43
第四章 全文结论  43-44
参考文献  44-51
致谢  51-52
作者简介  52-53
导师简介  53

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜寄生虫学
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