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四环素诱导的Cre重组酶表达载体的构建及其体外表达研究

作　者: 杨丽华
导　师: 周常文
学　校: 福建医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: Tet基因表达系统载体构建 Cre重组酶诱导表达条件性基因敲除
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

Cre/loxP系统介导的条件性基因敲除(conditional gene knockout)克服了传统基因敲除的诸多弊端,是基因功能研究的最重要的技术之一。在此基础上,Cre /loxP系统与Tet基因表达系统相结合建立起的诱导性条件性基因敲除技术,能够更精确地研究基因的功能。该技术需要制备两种遗传工程小鼠,一种是时间特异性可诱导表达Cre的转基因小鼠,另一种是目的基因片段两侧带有同向loxP位点的基因打靶小鼠,通过两种鼠系的杂交,可实现可诱导性的时间特异性的基因敲除。本研究构建和鉴定了两个诱导表达Cre的真核表达载体,并对这两个载体的转录活性进行了初步研究,为建立诱导性表达Cre的转基因小鼠及进一步制备条件性ADAM10基因敲除的小鼠奠定了基础,有助于开展ADAM10基因功能的研究。采用分子生物学技术,将Tet-On基因表达系统的pTRE载体线性化,并与pCre-IRES-EGFP质粒中长约2.7kb的片段连接,构建成重组质粒pTRE-Cre-EGFP(P1)。将P1与Tet-On基因表达系统中的另一载体pTet-On共转染293T细胞,加入或者不加强力霉素(Doxycycline,Dox),观察绿色荧光和Cre重组酶基因的表达。切下P1载体的部分片段Phcmv-Cre-EGFP与pTet-On载体的部分片段Pcmv-rtTA连接成Pcmv-rtTA-EGFP-Cre-Phcmv(P2)载体,将其转染入293T细胞,加入或者不加Dox诱导,对照观察绿色荧光和Cre重组酶基因的表达。P1与pTet-On的共转染及P2载体的单转染均以pCre-IRES-EGFP为阳性对照组,分别对诱导表达出的Cre重组酶基因进行RT-PCR鉴定。结果显示,经酶切和测序鉴定,成功构建了P1和P2载体。采用脂质体LP2000将P1与pTet-On质粒共转染293T细胞后,不加Dox时,没有或者很少表达绿色荧光;阳性对照组表达绿色荧光。而加入Dox后,P1与pTet-On质粒共转染的细胞诱导表达出绿色荧光;转染48小时后,分别提取其RNA,经RT-PCR检测表明,诱导表达出绿色荧光的细胞,均能检测出Cre基因的表达;反之,则检测不出Cre基因的表达,证实了绿色荧光和Cre基因的表达是一致的。采用LP2000将P2转染293T细胞后,不加Dox时,没有绿色荧光的表达,阳性对照组表达绿色荧光,而加入Dox后,P2的转染能诱导表达绿色荧光;转染48小时后分别提取其RNA进行RT-PCR检测,诱导表达出绿色荧光时均能从mRNA水平上检测出Cre基因的表达;反之,则检测不出Cre基因的表达。综上所述,得出以下结论:本研究成功构建并鉴定了诱导性表达Cre重组酶的载体(P1和P2)。P1和pTet-On质粒的共转染能在293T细胞中诱导表达绿色荧光,并能从mRNA水平上检测出Cre基因的表达。P2的转染也能在293T细胞中诱导表达绿色荧光,并能从mRNA水平上检测出Cre基因的表达。实验结果证明,本研究所构建的诱导性表达Cre的载体P1和P2均能以时间特异性的方式诱导表达Cre重组酶基因,从细胞水平上证实了P1和P2载体的基因元件在体外均能发挥正常的功能,可以用于制备诱导性表达Cre重组酶的转基因小鼠。而且,使用P2载体仅需制备一种转基因小鼠就能满足研究的需要。

全文目录

英文缩略词表  4-5
中文摘要  5-7
Abstract  7-10
前言  10-12
材料与方法  12-35
  一、重组质粒pTRE-Cre-EGFP（P1）的构建及鉴定  16-22
  二、重组质粒Pcmv-rtTA-EGFP-Cre-Phcmv(P2)的构建及鉴定  22-27
  三、载体P1的转染及体外表达研究  27-33
  四、载体P2的转染及体外表达研究  33-35
结果  35-45
讨论  45-47
结论  47-48
参考文献  48-52
综述  52-60
  参考文献  57-60
附录  60-61
致谢  61

四环素诱导的Cre重组酶表达载体的构建及其体外表达研究

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