学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

水稻白叶枯病菌受寄主诱导表达基因的鉴定及致病功能研究

作　者: 沈晴
导　师: 刘凤权
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻白叶枯病菌互作 2-DE qRT-PCR 诱导表达基因 xanA基因
分类号: S435.111.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 9次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）包括两个致病变种,分别是水稻白叶枯病菌（X. oryzae pv. oryzae,简称Xoo）和水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola,简称Xoc）。其中,Xoo从水稻的水孔侵入,引起白叶枯病；Xoc从水稻的气孔侵入,引起细菌性条斑病。一直以来,白叶枯病和细菌性条斑病是我国水稻生产上的两种重要的细菌病害。目前,对Xoo致病机理的研究主要集中在群体感应受体蛋白编码基因LuxR、无毒基因（如AvrXa7）、Ⅲ型分泌系统及其转运的效应因子、双组分调控系统（如PhoPQ双组分系统）、DSF型群体感应调控系统等基因和系统的功能分析,对于利用蛋白质组学,并从病原-寄主互作的角度来研究病原致病相关基因的研究则少有报道。近年来,随着水稻和白叶枯病菌全基因组序列的公布,该病害已成为植物-病原物互作研究的重要模式之一。从病原-寄主互作层面来克隆病菌中新的致病因子,研究它们的致病功能与作用机制,对于深入认知Xoo的致病机制、设计病害控制策略具有重要意义。为此,本研究利用蛋白质组学技术,分离并鉴定了水稻白叶枯病菌PX099菌株与水稻感病品种IR24互作不同时期（3 h、6 h、12 h）时被共同诱导表达的8个蛋白。通过PCR的方法克隆了编码这些蛋白的8个基因,并分别构建了这8个基因的突变株。致病性测定结果表明：这8个基因中,有6个基因的突变株致病性均减弱。挑选其中致病性完全丧失的xanA基因（NC 010717.1）突变株做进一步研究,并通过表型测定明确了其对细菌生长、胞外多糖的合成、生物膜的形成、抗氧化压力能力和细胞形态等方面的影响。具体内容如下：（一）将水稻白叶枯病菌PX099与感病水稻IR24水稻叶片组织提取液共培养3h、6 h、12 h后分别提取细菌总蛋白。利用蛋白质双向电泳技术,质谱技术及ImageMaster 2D platinum 5.0软件对互作过程中的差异表达蛋白进行分析。结果表明：与对照相比,互作3 h和6 h时,病原菌中各有29个蛋白差异表达,互作12 h时,病原菌中有38个蛋白差异表达。其中,有8个蛋白在这3个时间点均有显著的差异表达。进一步的质谱分析结果表明：这8个蛋白分别为磷酸葡萄糖变位酶PGM（gi|84622382）、精氨酸酶（gi|84622054）、GroEL伴侣蛋白（gi|21229998）、膜定位蛋白MinD （gi|84624994）、细菌铁蛋白（gi|84623542）、肌醇-1-环鸟苷激酶（gi|84624213）、亚精氨合成酶（gi|58579842）、铁结合核蛋白（gil84622991）。通过在NCBI上进行比对,查找编码这8个蛋白的基因,分别为：xanA（YP₀01915572.1）、rocF （YP₀01915898.1）、groEL （YP₀01911694.1）、minD （YP₀01912473.1）、bfr （YP 001914071.1）、PXO 00388 （YP 001913112.1）、PXO 03650 （YP 001911408.1）、PXO₀2027 （YP₀01914882.1）。利用qRT-PCR （quantitative real-time PCR）对这8个基因在互作1 h、3 h、6 h、12 h、18 h时的转录水平进行分析,结果表明这8个基因在12 h、18 h时被最显著的诱导表达。（二）根据水稻白叶枯病菌PXO99A的全基因组序列设计以上8个基因的引物,采用PCR方法从PX099中克隆了这8个基因,分别命名为xanA、rocF、groL、minD、bfr、imp、spd、pir。通过插入突变的方法,分别构建了这8个基因的突变株。利用剪叶法进行致病性测定,结果表明：除bfr、spd外,其余6个基因的突变株在感病水稻IR24上的致病性均减弱,其中,xanA基因的突变株致病性完全丧失。对xanA基因突变株进行生物膜、胞外多糖、HR反应等表型测定,结果表明：xanA基因的突变株生物膜形成受阻,胞外多糖产量降低,抗氧化压力能力减弱,细菌细胞形态发生改变。但是,在非寄主烟草上激发的过敏性反应情况与野生型菌株相似。

全文目录

摘要 6-8ABSTRACT 8-10第一部分文献综述 10-28 第一章水稻白叶枯病菌及其致病机理 10-20 1 水稻白叶枯病菌概述 10-12 2 病原细菌与植物的相互作用 12-20 2.1 病原菌致病因子 12-15 2.2 寄主植物的抗病反应 15-16 2.3 病原菌致病因子的调控 16-20 第二章蛋白质组学在植物-病原菌互作研究中的应用 20-28 1 蛋白质组学(Proteomics)简介 20-23 1.1 蛋白质组与蛋白质组学 20 1.2 蛋白质组学的分类 20-21 1.3 蛋白质组学的研究技术 21-23 2 蛋白质组学在植物-病原物互作研究中的应用 23-28 2.1 蛋白质组学在植物抗病机制研究中的应用 25-26 2.2 蛋白质组学在病原物致病机制研究中的应用 26-28第二部分研究内容 28-92 第一章水稻白叶枯病菌受水稻诱导表达基因的鉴定 28-62 1 材料与方法 29-44 1.1 供试菌株 29-30 1.2 水稻叶片组织提取液的制备 30 1.3 培养基及抗生素 30-31 1.4 细菌总蛋白质的提取和纯化 31 1.5 双向电泳 31-38 1.6 双向电泳凝胶图像分析 38 1.7 质谱分析前处理 38-40 1.8 质谱检测 40-41 1.9 荧光定量PCR 41-44 2 结果与分析 44-59 2.1 蛋白质差异表达分析 44-50 2.2 差异蛋白点的质谱鉴定 50-54 2.3 荧光定量PCR结果分析 54-59 3 讨论与总结 59-62 3.1 诱导表达基因的鉴定 59-60 3.2 诱导表达基因的验证 60-62 第二章诱导表达基因的克隆及突变体的构建 62-92 1 材料与方法 63-75 1.1 试验所涉及的菌株、质粒和引物 63-64 1.2 培养基及抗生素 64-66 1.3 细菌基因组DNA的提取 66-67 1.4 质粒的提取 67-68 1.5 PCR反应 68-69 1.6 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算 69 1.7 DNA酶切、连接和PCR扩增产物回收 69 1.8 质粒的转化 69-70 1.9 两亲交配 70-71 1.10 整合突变体的构建 71-72 1.11 xanA互补菌株的构建 72-74 1.12 致病性和HR的测定 74 1.13 生物膜的测定 74 1.14 胞外多糖的测定 74-75 1.15 抗氧化压力的测定 75 1.16 细胞形态的观察 75 1.17 生长曲线的测定 75 2 结果与分析 75-89 2.1 xanA、rocF、groL、minD、bfr、imp、spd、pir基因突变株的构建 75-82 2.2 八个突变株的致病性测定 82-83 2.3 xanA互补株的构建 83-84 2.4 xanA基因的突变影响细菌的致病性,但不影响HR反应 84-85 2.5 xanA基因的突变不影响细菌的正常生长 85-86 2.6 xanA基因的突变降低细菌胞外多糖(EPS)的产量 86-87 2.7 xanA基因的突变减少细菌生物膜的形成 87 2.8 xanA基因的突变减弱细菌抗H_2O_2的能力 87-88 2.9 xanA基因的突变影响细菌的细胞形态 88-89 3 讨论与结论 89-92 3.1 xanA基因与胞外多糖的产生相关 89 3.2 xanA基因与生物膜的形成相关 89 3.3 xanA基因与水稻白叶枯病菌致病性相关,对过敏性反应没有影响 89-90 3.4 xanA基因与水稻白叶枯病菌抗氧化压力的能力相关 90 3.5 xanA基因与水稻白叶枯病菌细胞形态相关 90-92发表或待发表的论文 92-94参考文献 94-102附录 102-116致谢 116

水稻白叶枯病菌受寄主诱导表达基因的鉴定及致病功能研究

内容摘要

全文目录

相似论文