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乌鲁木齐地区奶牛隐性乳房炎及金黄色葡萄球菌Fnbp基因原核表达的初步研究

作　者: 张向新
导　师: 石庆华；苏艳
学　校: 新疆农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 金黄色葡萄球菌奶牛隐性乳房炎流行病学的研究 Fnbp基因原核表达载体构建
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本试验对乌鲁木齐周边地区6个集约化奶牛场和4家散户隐性乳房炎发病情况进行了调查,对奶牛隐性乳房炎病例中金黄色葡萄球菌进行了分离、鉴定,并对其抗药性进行了初步研究。在调查中,隐性乳房炎的平均头阳性率和乳区阳性率分别为32.75%和15.11%,奶样中金黄色葡萄球菌的平均头分离率和乳区分离率分别为15.11%和6.32%。药物敏感性试验表明,在所调查的集约化牛场和散户中,隐性乳房炎病例中金黄色葡萄球菌药物敏感性基本相同,各牛场所分离菌株均对丁胺卡那、左氧氟沙星敏感。根据GenBank上发表的金黄色葡萄球菌Fnbp基因序列,设计合成一对引物,以金黄色葡萄球菌分离株的DNA为模板,采用PCR方法扩增Fnbp基因,得到1654bp的目的片段,将其插入到pMD18-T载体中,构建pMD18-T-Fnbp重组质粒,将其转入到E.coliDH5α中,进行酶切鉴定并测序验证。然后将目的片段与原核表达载体pGEX-4T-3连接,构建重组质粒pGEX-4T-Fnbp,将其转化到E.coliBL21中,进行酶切鉴定并测序验证。其阳性重组质粒经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE电泳分析可得表达产物与预期大小相符,约61.2KD。这为建立金黄色葡萄球菌免疫学诊断方法,研究针对金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎的治疗和候选亚单位疫苗的研制提供了理论依据,奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
英文缩略表  9-10
第1章综述  10-19
  1.1 研究目的与意义  10-11
  1.2 奶牛乳房炎的概念和分类  11-13
    1.2.1 临床型乳房炎  11-12
    1.2.2 隐性乳房炎  12
    1.2.3 奶牛乳房炎的病因  12-13
  1.3 金黄色葡萄球菌的生物学特性及其主要毒力因子  13-16
    1.3.1 金黄色葡萄球菌的生物学特性  13-14
    1.3.2 金黄色葡萄球菌的致病性及毒力因子  14
    1.3.3 金黄色葡萄球菌黏附素  14-15
    1.3.4 金黄色葡萄球菌致病机理  15-16
  1.4 金黄色葡萄球菌黏附素的研究进展  16-18
    1.4.1 金黄色葡萄球菌毒力因子FnbpA 的研究  16-17
    1.4.2 金黄色葡萄球菌Fnb 基因编码的蛋白及生物学功能  17-18
  1.5 论文的研究内容  18-19
第2章乌鲁木齐地区奶牛隐性乳房炎金黄色葡萄球菌的初步分离、鉴定  19-28
  2.1 试验材料  19-20
    2.1.1 试验菌株的收集  19
    2.1.2 主要培养基及其配制  19
    2.1.3 主要试剂和药品  19-20
    2.1.4 TH-16S 葡萄球菌属细菌生化编码鉴定系统  20
  2.2 试验方法  20-22
    2.2.1 乳样采集  20
    2.2.2 隐性乳房炎的检测  20
    2.2.3 病原菌的分离  20-21
    2.2.4 病原菌培养特性及形态学鉴定  21
    2.2.5 金黄色葡萄球菌的生化鉴定  21-22
    2.2.6 药物敏感试验  22
    2.2.7 动物致病性试验  22
  2.3 结果与分析  22-26
    2.3.1 金黄色葡萄球菌的分离及初步鉴定  22
    2.3.2 分离后的细菌革兰氏染色  22-23
    2.3.3 血琼脂平板试验  23
    2.3.4 高盐甘露醇培养试验  23-24
    2.3.5 隐性乳房炎检测结果  24-25
    2.3.6 药物敏感试验结果  25
    2.3.7 分离菌株的致病性  25-26
  2.4 讨论  26-28
    2.4.1 金黄色葡萄球菌的分离鉴定  26
    2.4.2 致病性金黄色葡萄球菌的耐药性与药物筛选  26-28
第3章金黄色葡萄球菌 Fnbp 基因克隆及原核表达的初步研究  28-44
  3.1 材料  28-29
    3.1.1 菌株  28
    3.1.2 载体  28
    3.1.3 工具酶、试剂盒及Marker  28
    3.1.4 相关试剂  28-29
    3.1.5 试剂配制  29
  3.2 试验仪器  29
  3.3 试验方法  29-37
    3.3.1 引物的设计与合成  29-30
    3.3.2 金黄色葡萄球菌基DNA 的提取  30
    3.3.3 Fnbp 基因的PCR 扩增  30-31
    3.3.4 PCR 扩增产物的回收与纯化  31-32
    3.3.5 金黄色葡萄球菌Fnbp 基因的T-A 克隆  32-34
    3.3.6 重组表达载体的构建  34-36
    3.3.7 重组质粒的诱导表达  36
    3.3.8 表达蛋白的SDS-PAGE 鉴定  36-37
  3.4 结果与分析  37-42
    3.4.1 金黄色葡萄球菌基因组的提取  37
    3.4.2 金黄色葡萄球菌Fnbp 基因的PCR 扩增  37-38
    3.4.3 重组质粒pMD18-T-Fnbp 的鉴定  38-39
    3.4.4 序列测定与分析  39-40
    3.4.5 重组表达质粒pGEX-4T-Fnbp 的构建和鉴定  40-41
    3.4.6 pGEX-4T-Fnbp 基因的序列分析  41
    3.4.7 基因工程重组菌的诱导表达和SDS-PAGE 分析  41-42
  3.5 讨论  42-44
第4章结论  44-45
参考文献  45-50
附录  50-56
致谢  56-57
作者简历  57

乌鲁木齐地区奶牛隐性乳房炎及金黄色葡萄球菌Fnbp基因原核表达的初步研究

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