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CaMKⅡα-Cre转基因小鼠模型的建立

作　者: 郑杰辉
导　师: 周常文
学　校: 福建医科大学
专　业: 医学遗传学
关键词: CaMKⅡα Cre重组酶转基因小鼠 Cre/LoxP 条件性基因敲除
分类号: R-332
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 38次
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内容摘要

Cre/LoxP系统介导的条件性基因敲除技术(conditional gene knockout)是目前基因功能研究中最重要的技术之一,它克服了传统基因敲除技术存在的诸多弊端。在神经系统研究方面,该技术的运用可使基因敲除仅发生在大脑的某个亚区或发育过程的某个阶段,从而有利于对大脑基因功能进行精细研究。对于神经系统条件性基因敲除而言,组织特异性启动子的选择至关重要。研究表明,CaMKⅡα基因的表达具有较强时空特异性,符合制备前脑神经细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的要求。神经细胞特异性Cre表达载体(PCCEⅠ)已在前期研究工作中构建成功。本项研究是利用线性化的PCCEⅠ载体通过原核显微注射的方法制备CaMKⅡα- Cre转基因小鼠,并对小鼠体内各组织中Cre基因的表达进行检测,从而建立前脑神经细胞特异性表达Cre的转基因小鼠,为进一步制备条件性ADAM10基因敲除小鼠奠定基础,有助于对阿尔茨海默病发病机制进行研究。通过原核显微注射的方法将12.318 kb的转基因片段CaMKⅡα-Cre引入小鼠受精卵,获得子代小鼠81只,经PCR检测,有7只小鼠在基因组上整合有CaMKⅡα- Cre基因(编号分别为PCCE5、PCCE10、PCCE19、PCCE59、PCCE60、PCCE65和PCCE75),整合率为8.6%。将7只小鼠分别与野生型C57BL/6J小鼠杂交,通过PCR法筛选出阳性转基因小鼠。利用RT-PCR方法检测证实,Cre重组酶基因在PCCE10、PCCE19和PCCE60三个品系转基因小鼠的前脑皮层和海马中有转录活性,而在其它组织中无转录活性。将CaMKⅡα- Cre转基因小鼠与ADAM10~LoxP/LoxP转基因小鼠杂交,利用PCR法证实在子代双重转基因小鼠中,Cre重组酶仅在前脑皮层和海马中介导LoxP位点间的基因重组。再将CaMKⅡα- Cre转基因小鼠与ROSA26-LacZ报告基因小鼠杂交,检测LacZ基因在子代双重转基因小鼠中表达的组织分布,结果表明,出生后第1天(P1),LacZ基因仅在前脑和海马的神经细胞中散在表达;出生后4周,LacZ基因在大脑(尤其是前脑和海马)中有明显表达,而在其它组织中无表达;而在胚胎期第16天(E16),LacZ基因在整个大脑中均无表达,从而证实了Cre重组酶在小鼠出生后发挥了重组的功能。最后,通过实时荧光定量PCR方法检测三个品系的CaMKⅡα-Cre转基因首建鼠的外源基因拷贝数,结果表明PCCE10、PCCE19和PCCE60的外源基因插入拷贝数分别为19、7和5。并且,用遗传育种的方法证实了筛选出的子代纯合子转基因小鼠。综上所述,本研究制备的CaMKⅡα-Cre转基因小鼠在前脑中特异性表达Cre重组酶并能成功地介导LoxP位点间的基因重组,建立起的纯合子转基因小鼠品系为神经系统相关疾病的基因功能研究提供了宝贵的工具小鼠。

全文目录

英文缩略词表  4-5
中文摘要  5-7
Abstract  7-9
第一章前言  9-12
第二章材料与方法  12-29
  2.1 材料  12-15
  2.2 转基因小鼠的制备  15
  2.3 转基因小鼠的繁殖  15-16
  2.4 转基因小鼠的基因型鉴定  16-18
  2.5 RT-PCR 检测转基因小鼠中Cre基因的转录活性  18-21
  2.6 转基因小鼠中Cre 重组酶表达活性及组织特异性的检测  21-26
  2.7 转基因小鼠外源基因拷贝数的检测和纯合子小鼠的筛选  26-29
第三章结果  29-40
第四章讨论  40-43
结论  43-44
参考文献  44-47
致谢  47-48
综述  48-56
  参考文献  54-56

CaMKⅡα-Cre转基因小鼠模型的建立

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