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补阳还五汤有效部位对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

作　者: 吴常青
导　师: 董六一
学　校: 安徽医科大学
专　业: 药理学
关键词: 脑缺血再灌注损伤肿瘤坏死因子-α 白细胞介素-1β 补阳还五汤有效部位海马神经元凋亡
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:研究补阳还五汤有效部位（总苷和黄酮）（EFBHD）对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤以及对HT22海马神经元细胞缺糖缺氧损伤的保护作用,并探讨其作用机制,为临床补阳还五汤有效部位的抗脑缺血作用的药物开发及应用提供理论依据和实验依据。方法:1、采用改良的线栓法,建立大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）的脑缺血再灌注损伤动物模型,观察EFBHD对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。在脑缺血再灌注24h后,对大鼠进行神经功能缺失症状评分,行TTC染色测脑梗死体积,测血清中乳酸脱氢酶（LDH）的活性和丙二醛（MDA）的含量,酶联免疫吸附法（ELISA法）测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的含量变化。行HE染色观察脑组织病理结构的改变,免疫组化法观察缺血脑组织TNF-α、NF-κB/p65和Nestin蛋白的表达情况。2、采用连二亚硫酸钠和低糖DMEM培养基共同制备HT22海马神经元细胞缺糖缺氧损伤模型,观察EFBHD对损伤HT22海马神经元细胞的保护作用。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞存活率,检测细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）和丙二醛（MDA）含量,采用Hoechst33342荧光核染色法检测HT22细胞的凋亡,应用流式细胞技术检测HT22海马神经元细胞凋亡百分率。结果:1、神经功能症状评分和梗死体积的测定:实验结果显示,与正常组相比,模型组大鼠脑缺血再灌注后表现出严重的神经功能缺失症状,TTC染色显示梗死灶非常明显。与模型组相比,EFBHD可改善神经功能症状,并且有效地减小缺血再灌注后梗死体积,其中以EFBHD(200mg·kg^-1)组效果最为明显。2、血清生化指标的测定:模型组大鼠血清中LDH活性和MDA含量明显升高,且血清中TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症细胞因子的含量升高,而EFBHD(200mg·kg^-1)可以显著抑制血清中LDH活性,降低血清中MDA含量及TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症细胞因子的水平,提示EFBHD可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤引起的脂质过氧化反应及炎症反应。3、HE染色结果显示:假手术组脑组织层次分明,神经细胞形态结构正常;模型组缺血侧脑组织的神经细胞稀疏,可见大量变性坏死细胞,胞体皱缩,组织水肿,排列紊乱。而EFBHD组神经元细胞数量均有所增加,变形、坏死神经元减少,损伤明显减轻。4、免疫组化结果显示:假手术组缺血侧脑组织可见少量的TNF-α和NF-κB/p65阳性细胞的表达,而模型组的TNF-α和NF-κB/p65阳性细胞大量表达,EFBHD(100、200mg·kg^-1)组能显著抑制缺血周边区、皮层区及海马区的TNF-α和NF-κB/p65阳性细胞的表达。假手术组大鼠脑组织未见Nestin阳性细胞表达,而模型组脑组织仅见其有微弱表达,EFBHD(100、200mg·kg^-1)组显著促进Nestin阳性细胞的表达。5、对HT22海马神经元细胞活力的影响:正常组HT22海马神经元细胞胞体饱满而透亮,贴壁良好,呈锥体状或多极形,细胞轴突交错成网络状。当缺糖缺氧诱导HT22海马神经元细胞凋亡后,胞体的轴突减少,胞间联系减少,贴壁不紧,部分细胞团明显脱落,胞体折光性下降。与模型组比较,EFBHD(100、300mg·L^-1)组能显著改善凋亡的细胞形态,提高HT22海马神经元细胞对MTT的摄取能力,并且抑制LDH的漏出,减少MDA的含量,改善HT22海马神经元细胞存活率。6、对HT22海马神经元细胞凋亡的影响:1)Hoechst33342荧光染色结果显示:正常组胞核呈卵圆形,呈弥散均匀的蓝色荧光。模型组出现凋亡小体等典型的形态学改变,凋亡细胞核碎裂,呈半月形或碎块状,并发出强亮的蓝色荧光。EFBHD各剂量组均能明显抑制HT22海马神经元凋亡,凋亡小体的数量都大大减少,以高剂量组尤为明显。2)流式细胞术检测结果显示:正常组凋亡峰很低,细胞凋亡率约为1.2%,而模型组凋亡率大大高于正常组,于此相比,EFBHD(100、300mg·L^-1)组显著的降低凋亡峰高度,减少凋亡率,提示EFBHD可通过抑制细胞凋亡来发挥缺血损伤的保护作用。结论:1、EFBHD对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用,其机制可能与抑制缺血再灌注损伤脑组织中炎症因子的分泌和表达,减轻脑组织的炎症反应有关。2、EFBHD对大鼠HT22海马神经元细胞缺糖缺氧损伤模型具有明显的保护作用,其机制可能与抗氧化、减轻细胞凋亡有关。

全文目录

英文缩略词表  7-9
中文摘要  9-12
英文摘要  12-15
前言  15-17
第一部分：补阳还五汤有效部位对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究  17-38
  1.实验材料  17-18
    1.1 实验动物  17
    1.2 药品与试剂  17-18
    1.3 主要仪器  18
  2.实验方法  18-22
    2.1 动物分组及给药  18-19
    2.2 大鼠脑缺血再灌注(MCAO)损伤模型的制备  19
    2.3 神经功能缺失症状评分  19-20
    2.4 大鼠血标本的采集及脑梗死体积的测定  20
    2.5 血清各指标的测定  20
    2.6 用于病理及免疫组化检测脑组织标本的采集  20
    2.7. HE 染色  20-21
    2.8 免疫组织化学检测  21-22
    2.9 数据处理  22
  3.实验结果  22-33
    3.1 补阳还五汤有效部位对MCAO 大鼠神经功能缺失症状评分和脑梗死体积比的影响  22-23
    3.2 补阳还五汤有效部位对MCAO 大鼠血清中LDH 活性和MDA 含量的影响  23-24
    3.3 补阳还五汤有效部位对MCAO 大鼠血清细胞因子TNF-α.IL-1β.IL-6  含量的影响  24-25
    3.4 补阳还五汤有效部位对MCAO 大鼠脑组织病理形态学影响  25-27
    3.5 补阳还五汤有效部位对MCAO 大鼠脑组织TNF-α.NF-κB/p65 和 Nestin 蛋白表达的影响  27-33
      3.5.1 免疫组化法检测脑组织TNF-α蛋白表达水平  27-29
      3.5.2 免疫组化法检测脑组织NF-κB/p65 蛋白表达水平  29-31
      3.5.3 免疫组化法检测脑组织Nestin 蛋白表达水平  31-33
  4.讨论  33-37
    4.1. MCAO 动物模型的选择  33-34
    4.2 补阳还五汤有效部位对MCAO 再灌注损伤大鼠脑梗死体积的影响  34
    4.3 补阳还五汤有效部位对MCAO 再灌注损伤大鼠炎症反应的影响  34-35
    4.4 补阳还五汤有效部位对MCAO 再灌注损伤大鼠TNF-α.NF-κB/p65 和Nestin 蛋白表达水平的影响  35-37
  5.结论  37-38
第二部分：补阳还五汤有效部位对HT22 海马神经元细胞缺糖缺氧损伤的保护作用及机制研究  38-52
  1. 实验材料  38-39
    1.1 HT22 海马神经元细胞株  38
    1.2 药品与试剂  38-39
    1.3 主要仪器  39
  2. 实验方法  39-41
    2.1 HT22 海马神经元细胞的培养  39-40
    2.2 Na_2S_2O_4 致HT22 海马神经元细胞缺糖缺氧损伤模型的制备及分组  40
    2.3 细胞上清液中LDH 和MDA 的测定  40
    2.4 MTT 法测HT22 海马神经元细胞活力值  40
    2.5 Hoechst33342 荧光核染色检测HT22 海马神经元细胞凋亡  40-41
    2.6 流式细胞仪（FCM）测HT22 海马神经元细胞凋亡率  41
    2.7 统计学处理  41
  3.实验结果  41-49
    3.1 补阳还五汤有效部位对HT22 海马神经元细胞缺糖缺氧损伤的形态学影响  41-43
    3.2 补阳还五汤有效部位对HT22 海马神经元缺糖缺氧损伤细胞存活率.LDH和MDA 影响  43-44
    3.3 补阳还五汤有效部位对HT22 海马神经元细胞缺糖缺氧损伤凋亡的影响  44-46
    3.4 补阳还五汤有效部位对HT22 海马神经元细胞缺糖缺氧损伤凋亡率的影响  46-49
  4.讨论  49-51
    4.1 阳性药EGB 的选择  49-50
    4.2 补阳还五汤有效部位对HT22 海马神经元细胞活力影响  50
    4.3 补阳还五汤有效部位对HT22 海马神经元细胞凋亡影响  50-51
  5.结论  51-52
参考文献  52-58
附录  58-59
致谢  59-60
综述  60-72
  参考文献  68-72

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