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膜联蛋白A2对人胃癌细胞生物学行为影响的研究

作　者: 李鹏鸽
导　师: 侯颖春
学　校: 陕西师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 膜联蛋白A2 胃癌 细胞增殖 细胞凋亡 细胞运动 RNA干扰
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


背景与目的胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤。早期诊断率低,术后复发、转移依然是目前导致胃癌患者死亡的主要原因。因此,探索胃癌发生与发展的作用机制对克服当前治疗胃癌的困境至关重要。近年米,分子靶向治疗为胃癌患者长期以来生存时间短、化疗和放疗效果有限的现状开创了新的局面。RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术具有高效性、特异性等特点,在肿瘤基因治疗研究方面已呈现出良好的应用前景。膜联蛋白A2 (AnnexinA2, ANXA2),其异常表达和人类多种肿瘤的发生、转移、病理分级及预后相关,研究显示其在胃癌细胞中也呈现高表达。本文以ANXA2为靶点,应用RNAi技术,设计靶向该蛋白mRNA的siRNA及其表达载体,以期通过实现对ANXA2基因表达的抑制初步探究ANXA2表达水平对胃癌细胞增殖、凋亡和运动能力的影响,进而分析该基因与人胃癌细胞生物学行为的相关性并探究其可能的作用机制,为进一步探索ANXA2在肿瘤中的功能机理和抗胃癌发生发展的研究积累资料。方法1.从GenBank搜索人ANXA2基因信息,利用在线软件筛选有效干扰靶点,合成干扰序列和错义对照序列并将其克隆至质粒表达载体pU6H1,构建干扰重组质粒和错义对照重组质粒。2.采用磷酸钙转染法,优化转染条件提高转染效率,将重组质粒导入胃癌细胞SGC-7901。3.以半定量RT-PCR、western blot检测转染24h、48h、72h和96h后ANXA2 mRNA与蛋白表达水平,分析其表达是否被有效抑制。4.以MTT法检测靶向ANXA2基因沉默对SGC-7901细胞增殖的影响。5.以Hoechst33258染色、MitoViewTM633染色结合流式细胞仪检测靶向ANXA2基因沉默对SGC-7901细胞凋亡的影响。6.以体外损伤修复法评价靶向ANXA2基因沉默对SGC-7901细胞运动能力的影响。7. RT-PCR与western blot检测靶向ANXA2基因沉默对FAK mRNA及蛋白表达水平的影响。结果1.筛选设计出了针对人ANXA2基因的四个有效干扰靶点,经鉴定各重组质粒构建成功。2.优化的磷酸钙法转染条件：转染前60%-80%细胞汇合率、6μg质粒剂量/30mm平皿、20min-30min沉淀复合物形成时间和16h孵育时间,此条件下可获得较高转染效率。3.以磷酸钙转染法将靶向ANXA2的pU6H1-siANXA2重组干扰质粒导入SGC-7901细胞后,细胞表达ANXA2的mRNA及蛋白水平均被有效抑制。4.MTT法、Hoechst33258染色、MitoViewTM633染色结合流式细胞仪检测及损伤修复法检测结果显示,当ANXA2基因表达下调后,SGC-7901细胞的增殖能力下降,生长变慢；出现明显的凋亡特征,细胞凋亡比率增加；细胞运动迁移能力不同程度降低。此外,ANXA2基因沉默对FAK总mRNA与总蛋白表达水平无显著影响。结论靶向人ANXA2基因的siRNA导入胃癌细胞SGC-7901后引起ANXA2特异性基因沉默,显著降低其体外增殖和运动能力并增强凋亡。因此,ANXA2基因与胃癌SGC-7901细胞的生物学行为密切相关,提示ANXA2具有成为胃癌基因治疗或药物治疗新靶点的潜在性。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-9
英文缩略词一览表  9-11
第1章 引言  11-26
  1.1 膜联蛋白A2(ANXA2)与肿瘤进程研究进展  11-23
    1.1.1 膜联蛋白家族与肿瘤简介  11-12
    1.1.2 ANXA2的生物学结构特性及活性调节  12-13
    1.1.3 ANXA2与肿瘤  13-23
  1.2 RNA干扰技术(RNAi)  23-26
    1.2.1 RNAi的发现与作用机制  23-24
    1.2.2 RNAi的生物学意义  24
    1.2.3 RNAi应用于胃癌基因治疗  24
    1.2.4 磷酸钙转染法  24-26
第2章 本课题的研究内容与意义、技术路线及创新之处  26-28
第3章 靶向ANXA2的siRNA质粒表达载体的构建与鉴定及其对ANXA2基因沉默效应的分析  28-51
  3.1 实验材料  28-32
    3.1.1 细胞株与菌株  28
    3.1.2 主要试剂  28-32
  3.2 实验仪器设备  32
  3.3 实验方法  32-40
    3.3.1 靶向ANXA2基因的siRNA设计  32-33
    3.3.2 携带ANXA2-siRNA质粒表达载体的构建与鉴定  33
    3.3.3 质粒制备与鉴定  33-34
    3.3.4 细胞培养  34-35
    3.3.5 细胞转染与效率评估  35
    3.3.6 半定量RT-PCR检测重组质粒对ANXA2 mRNA表达水平的抑制  35-38
    3.3.7 Western blot检测重组质粒对ANXA2蛋白表达水平的抑制  38-40
    3.3.8 统计学处理  40
  3.4 结果  40-48
    3.4.1 ANXA2 RNAi质粒表达载体的构建与鉴定  40-42
    3.4.2 ANXA2 RNAi质粒转染效率评估  42
    3.4.3 RT-PCR分析ANXA2 mRNA表达水平  42-46
    3.4.4 Western blot检测ANXA2蛋白表达水平  46-48
  3.5 讨论  48-51
第4章 ANXA2基因沉默对胃癌细胞生物学行为影响的研究  51-64
  4.1 实验材料  51-52
    4.1.1 质粒及细胞株  51
    4.1.2 主要试剂  51
    4.1.3 主要试剂的配制  51-52
  4.2 实验仪器设备  52
  4.3 实验方法  52-55
    4.3.1 细胞培养与质粒制备(同第3章)  52
    4.3.2 实验分组与转染  52
    4.3.3 体外损伤修复法  52-53
    4.3.4 细胞增殖分析  53
    4.3.5 细胞凋亡检测  53-54
    4.3.6 RT-PCR与western blot检测FAK mRNA及蛋白表达水平  54-55
    4.3.7 统计学处理  55
  4.4 结果  55-59
    4.4.1 ANXA2-siRNA对SGC-7901细胞运动能力的影响  55-56
    4.4.2 ANXA2-siRNA对SGC-7901细胞增殖能力的影响  56-57
    4.4.3 ANXA2-siRNA对SGC-7901细胞凋亡的影响  57-58
    4.4.4 ANXA2-siRNA对FAK mRNA和蛋白表达水平的影响  58-59
  4.5 讨论  59-64
总结  64-65
参考文献  65-74
致谢  74-75
攻读硕士学位期间的科研成果  75

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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