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犬瘟热病毒单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

作　者: 孙玮
导　师: 夏咸柱
学　校: 吉林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: CDV 单克隆抗体荧光抗体
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

犬瘟热病毒与麻疹病毒、牛瘟病毒、小反刍兽疫病毒、鲸类麻疹病毒同属于副粘病毒科、麻疹病毒属。大部分的CDV可以归结为七个主要遗传谱系:America-1(主要的疫苗株),America-2, Asia-1, Asia-2, Europe, Artic-like和欧洲野毒株。CDV被认为只有一个抗原型,但是相同基因型的CDV具有不同的致病性和细胞嗜性已被证实。CDV是引发犬瘟热病的致病因子,它会引起犬科动物产生严重的、具有典型特征的全身性疾病,包括高热、呼吸道、胃肠道疾病和神经系统紊乱。在二十世纪五十年代,犬瘟热因犬瘟热弱毒疫苗的广泛应用而得到了有效的控制,但是最近今年,有多个已经免疫的动物发生犬瘟热感染的报道,并且犬瘟热在犬科动物、毛皮经济动物中的发病率逐渐升高,造成了很大的经济损失。建立一种快速、准确、特异的诊断方法,开展犬瘟热病毒特性及单克隆抗体的研究,以制备犬瘟热荧光抗体,对于犬瘟热致病机理和该病的预防、治疗具有重要意义。本实验主要由以下三部分组成:一,犬瘟热病毒的培养及纯化。通过优化培养液PH值,改善转瓶培养条件,从而获得大量CDV;去细胞碎片后,用PEG6000进行病毒浓缩沉淀,最后通过Sephrose 4 FF凝胶层析柱纯化。电镜观察,用此纯化方法获得的犬瘟热病毒形态完整、病毒含量高。经测定,蛋白含量为2.713mg/mL;二,犬瘟热单克隆抗体的制备。用获得的病毒去免疫Balb/C小鼠。采用PEG融合法,将SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞融合。三次有限稀释法克隆,用间接ELISA进行筛选,最后得到了稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2F7,3G2,5E3。用已经建立的ELISA方法测定3株杂交瘤细胞的培养上清和腹水效价,2F7,3G2,5E3培养上清效价分别为28、26、25,腹水效价分别为106、104、103。亚型鉴定结果,2F7为IgG2a型,3G2为IgG1,5E3为IgGM。用Protein G蛋白柱纯化得到的腹水,经测量IgG含量为2.483mg/mL;污染的杂交瘤细胞的拯救。充分利用了巨噬细胞在小鼠体内或体外的吞噬能力,清除了细胞中的霉菌污染和细菌污染,成功拯救了一株杂交瘤细胞;三,犬瘟热荧光抗体的制备。将纯化后的单抗用异硫氰酸荧光素(FITC)标记制备荧光抗体,并对其效价、特异性进行测定。结果表明,用2F7制备的荧光抗体具有很好特异性,染色效价为1:256,满足了犬瘟热病毒实验室快速、特异性检测的需求。本研究获得的犬瘟热病毒特异性单克隆抗体和荧光标记抗体为进一步研制诊断试剂奠定了基础。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-8
英文缩写词表  8-11
前言  11-12
第一篇文献综述  12-25
  第1章犬瘟热病毒的研究进展  12-22
    1 病毒特征  12-13
    2 自然宿主和不同的CDV 毒株  13-14
    3 流行病学  14-15
    4 犬瘟热的发病机理  15-18
    5 病毒感染机体产生的保护性免疫  18
    6 CDV 存在于机体的主要原因  18-19
    7 鉴别诊断  19-20
    8 治疗与预防  20-22
  第2章犬瘟热病毒分子生物学研究进展  22-25
    1 犬瘟热病毒基因组结构  22-25
第二篇研究内容  25-52
  第1章犬瘟热病毒的培养及纯化  25-33
    1 实验器材  25-26
    2 方法  26-29
    3 结果  29-30
    4 讨论  30-32
    5 小结  32-33
  第2章犬瘟热病毒单克隆抗体的制备  33-47
    1 实验器材  33-34
    2 方法  34-42
    3 结果  42-45
    4 讨论  45-46
    5 小结  46-47
  第3章犬瘟热荧光抗体的制备  47-52
    1 实验器材  47
    2 荧光抗体的制备  47-48
    3 结果  48-50
    4 讨论  50-51
    5 小结  51-52
结论  52-53
参考文献  53-60
致谢  60-61
导师简介  61-63
作者简介  63

犬瘟热病毒单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

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