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转小麦泛素基因烟草的低温耐性的研究

作　者: 冯亚楠
导　师: 王玮
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物学
关键词: 泛素转基因低温胁迫氧化损伤光合作用蛋白质羰基化
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

泛素/26S蛋白酶体途径（ubiquitin/26S proteasome pathway, UPP）是目前已知最重要的、有高度选择性的蛋白质降解途径。逆境胁迫下生物细胞内无功能蛋白质的积累增多,及时清除这些无功能蛋白质成为生物适应逆境的重要方式。已有研究表明,泛素基因在逆境条件下表达显著增加,短命调节蛋白及异常蛋白降解速率加快,间接说明泛素系统在生物逆境适应中的作用。本实验室已经克隆了小麦单体泛素基因,构建了正义表达载体,转化烟草获得了过量表达泛素基因的转基因株系多个;同时克隆了烟草的泛素基因,构建了反义表达载体,反义转化烟草获得了抑制烟草泛素基因表达的转基因株系多个。研究发现过量表达泛素提高了烟草的抗旱性、耐盐性。本研究以正义Ta-Ub2泛素基因系（T₂-2, T₂-11, T₂-13）、转反义Nt-Ub1泛素基因系（AT₂-1,AT₂-3,AT₂-10）以及转空载体对照植株（T-GUS）为材料,低温4℃或10℃胁迫处理1-5d,室温恢复3d,研究过量表达泛素基因对转基因烟草低温耐性的影响。从低温胁迫下转泛素基因烟草的外部形态变化、光合能力、渗透调节能力、膜伤害程度、活性氧积累与清除、抗氧化酶活性、泛素蛋白表达情况以及蛋白质氧化损伤等多个方面,分析了泛素系统影响植物低温性的生理生化机制。主要结果如下:（1）低温胁迫造成烟草光合机构受到损伤,导致光合速率（Pn）、PSII最大光化学效率（Fv/Fm）、PSII实际光化学效率（ФPSII）下降。相对于对照植株（野生型和转空载体烟草）,过量表达Ta-Ub2泛素基因的转基因植株Pn、Fv/Fm、ФPSII下降相对缓慢,表明低温胁迫下,过量表达Ta-Ub2泛素基因的转基因植株光合机构的稳定性维持较好,特别是减轻了低温对PSII的光抑制。（2）低温胁迫引起细胞脱水。过量表达泛素基因使转基因株系中脯氨酸、可溶性糖的积累多,渗透调节能力较强,有效的防止了细胞的低温脱水现象。抑制泛素基因表达的转基因植株中脯氨酸、可溶性糖的积累量少,渗透调节低,水分状况维持较差。（3）低温胁迫引起生物膜损伤,导致膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量和膜透性增加。过量表达泛素基因的转基因株系,细胞膜受低温伤害的程度较轻,表现为MDA含量及电解质外渗量较低,有效保护了生物膜的稳定性和完整性;相反,抑制泛素基因表达导致低温胁迫下生物膜的损伤更为严重。（4）低温胁迫导致超氧阴离子自由基(O₂^·-)生成速率和过氧化氢（H₂O₂）积累增多。过量表达泛素基因的转基因株系中,主要抗氧化酶（SOD, CAT, POD, APX）的活性相对较高,超氧阴离子生成速率和过氧化氢积累较少。抑制泛素基因表达则加剧转基因植株体内超氧阴离子和过氧化氢的积累。（5）对烟草泛素蛋白进行免疫印迹杂交发现,无论在正常生长条件还低温处理条件下,过量表达泛素基因转基因株系与野生型植株的泛素单体蛋白水平没有显著差异,但过量表达泛素基因植株的结合态泛素积累明显高于野生型植株。（6）低温胁迫导致了烟草叶片细胞蛋白质的氧化损伤,而蛋白质羰基化是不可逆的过程,是蛋白质氧化的主要产物。对过量表达泛素基因的转基因植株进行蛋白质免疫印迹杂交,分析羰基化蛋白质含量。结果发现低温处理后过量表达泛素基因的转基因植株蛋白质羰基化程度明显的比对照植株轻,表明过量表达泛素基因在一定程度上减轻了低温对蛋白质氧化损伤。综上所述,过量表达泛素单体提高了转基因烟草植株对低温胁迫的适应能力,抑制泛素基因的表达则降低了转基因植株耐低温能力。说明泛素系统与植物的低温耐性关系密切,通过改善泛素系统可以提高植物的低温逆境适应性。

全文目录

中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
1 前言  12-21
  1.1 泛素的结构  13-15
    1.1.2 泛素基因种类  14-15
  1.2 泛素/26S 蛋白酶体途径  15-18
    1.2.1 泛素途径中的主要成分  15-16
    1.2.2 泛素/26S 蛋白酶体途径的生理功能  16-18
  1.3 依赖泛素/26S 蛋白酶体途径蛋白降解与植物环境胁迫抗性  18-20
    1.3.1 热胁迫  18-19
    1.3.2 冷胁迫  19
    1.3.3 干旱  19-20
  1.4 本研究的目的及意义  20-21
2 材料与方法  21-27
  2.1 实验材料与处理  21
    2.1.1 植物材料  21
    2.1.2 材料培养与处理  21
    2.1.3 生化试剂  21
  2.2 实验方法  21-26
    2.2.1 蛋白杂交分析  21-25
    2.2.2 生理指标的测定  25-26
  2.3 统计分析  26-27
3 结果与分析  27-40
  3.1 低温胁迫及温度恢复过程中转泛素基因烟草外部形态的变化  27
  3.2 低温胁迫对转泛素基因烟草光合机构的影响  27-31
    3.2.1 低温胁迫对转泛素基因烟草叶片光合作用的影响  27-29
    3.2.2 转正义泛素基因烟草叶片PSII 光化学效率对低温胁迫响应  29-31
  3.3 低温胁迫对转正、反义泛素基因烟草渗透调节物质的影响  31-32
  3.4 低温胁迫对转正、反义泛素基因烟草植株生物膜稳定性的影响及其与抗氧化能力的关系  32-37
    3.4.1 低温胁迫对转正、反义泛素基因烟草叶片MDA 及电解质外渗量的影响  32-33
    3.4.2 低温胁迫对转正、反义泛素基因烟草超氧阴离子自由基和过氧化氢含量的影响  33-35
    3.4.3 低温胁迫对正、反义转基因烟草叶片抗氧化酶活性的影响  35-37
  3.5 不同转基因烟草泛素蛋白表达对低温胁迫的响应  37-38
  3.6 低温胁迫对转泛素基因烟草叶片细胞蛋白氧化损伤的影响  38-40
4 讨论  40-45
  4.1 过量表达泛素基因Ta-Ub2 提高了转基因植株的低温耐性  40-41
  4.2 过量表达泛素基因Ta-Ub2 保护了光系统II 的活性提高了转基因烟草在低温胁迫下的光合作用  41
  4.3 过量表达泛素基因Ta-Ub2通过改善抗氧化系统降低了细胞活性氧水平提高植物的低温胁迫耐性  41-45
    4.3.1 过量表达泛素基因Ta-Ub2 减轻了膜脂过氧化程度较好地维持了生物膜的完整性  42
    4.3.2 过量表达泛素基因Ta-Ub2 减少了活性氧积累  42-43
    4.3.3 过量表达泛素基因Ta-Ub2 减轻了活性氧造成的蛋白质羰基化  43-45
5 结论  45-46
参考文献  46-53
致谢  53

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