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重组人Galectin-1蛋白的表达、纯化及生物活性的检测

作　者: 李晶
导　师: 张英起；张伟
学　校: 第四军医大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人Galectin-1 表达纯化活性检测
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

Galectin-1为半乳糖凝集素(galectin)家族的重要成员之一,由135个氨基酸组成,与β-半乳糖苷具有特殊亲和力,常以单体和同源二聚体形式存在,表达于多种类型的细胞,在胸腺、平滑肌、肾脏、心肌、骨骼肌中含量丰富,具有重要的生物学功能。在神经系统中,Galectin-1参与系统发育并调节神经细胞的增殖。在免疫系统中,Galectin-1诱导胸腺细胞和活化的T细胞的凋亡从而对T细胞进行调节,并抑制炎性因子的分泌。在某些肿瘤组织中发现Galectin-1高表达,普遍参与肿瘤的发生、迁移、黏附,肿瘤血管的生成。目前大量研究表明Galectin-1可以预防和治疗多种自身免疫性疾病,具有广阔的临床应用前景。然而,相关的动物模型实验必须给予相对高浓度的Galectin-1才能得到理想的结果。若应用于人体,则每天的剂量相当于4mg/kg,这样大的剂量无疑给Galectin-1应用于临床带来了困难。因此,如何提高Galectin-1的活性已成为其应用于临床急需解决的问题。文献报道在体内,二聚体Galectin-1在维持免疫系统稳态过程中较单体Galectin-1具有更高的活性。而且,Patrick B?ttig等将两个Galectin-1基因串联在一起,表达的二串体重组蛋白在诱导鼠类胸腺细胞和成熟T细胞凋亡试验中比天然的单体Galectin-1表现出更强的诱导凋亡活性。因此,本课题拟采用类似设计方案,表达单体和二串体Galectin-1,筛选高活性蛋白。为了实现上述目的,首先本课题以含有Galectin-1基因的质粒pACT-Gal-1为模板,利用PCR技术获得单体Galectin-1基因及二串体Galectin-1基因,并选择带有his标签的质粒pQE-30和本教研室改构的不含his标签的表达质粒pET-22b(+)为表达载体,通过双酶切后,将基因与表达载体相连接,构建含有Galectin-1基因的重组质粒,分别转化大肠杆菌M15和BL21(DE3)感受态细胞,构建工程菌。然后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况,再经Ni柱亲和层析及阴阳离子交换等不同层析方法纯化目的蛋白。最后,通过红细胞凝集试验和Jurkat细胞增殖抑制试验检测纯化所得目的蛋白的生物活性。本课题通过对以上三方面的研究,共获得如下结果:1)成功构建了M15/pQE-30-Gal-1、BL21/pET-22b(+)-Gal-1、BL21/pET-22b(+)-Gal-1②工程菌,双酶切鉴定和基因测序结果均正确。2)通过Ni柱亲和层析得到纯度大于95%的His-Gal-1蛋白;通过Q阴离子交换层析和SP阳离子交换层析纯化得到纯度约为90%的Gal-1蛋白和二串体Gal-1②蛋白,Western blot结果显示均为预期目的蛋白。3)三种重组蛋白均有红细胞凝集活性和抑制Jurkat细胞增殖活性,且二串体Gal-1②蛋白较His-Gal-1和Gal-1蛋白表现出了更强的生物活性。综上所述,我们得到了高活性的Gal-1②重组蛋白,有望成为治疗自身免疫性疾病的候选新药。

全文目录

缩略语表  6-11
中文摘要  11-14
英文摘要  14-17
前言和文献回顾  17-29
  前言  17-18
  文献回顾  18-29
    1 半乳糖凝集素  18-19
    2 Galectin-1的生物化学特征  19-20
    3 Galectin-1 的生物学作用  20-29
正文  29-67
  实验一重组Galectin-1 表达载体的构建  29-50
    1 材料  29-34
    2 方法  34-40
    3 结果  40-48
    4 讨论  48-50
  实验二重组Galectin-1 蛋白的表达、纯化及鉴定  50-62
    1 材料  50-51
    2 方法  51-54
    3 结果  54-60
    4 讨论  60-62
  实验三重组Galectin-1 蛋白的生物活性检测  62-67
    1 材料  62-63
    2 方法  63-64
    3 结果  64-65
    4 讨论  65-67
小结  67-68
参考文献  68-80
个人简历和研究成果  80-81
致谢  81

重组人Galectin-1蛋白的表达、纯化及生物活性的检测

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